Биомолекулаларды тазартудың жуықту хроматографиясы әдісі

Кіріспе

Биомолекулаларды тазарту техникасы

Аффиниттік хроматография – биомолекула мен басқа зат арасындағы өте специфиялық макромолекулалық байланыс негізінде қоспадан биомолекуланы бөлу әдісі. Бұл байланыстың нақты түрі қызығушылық тудыратын биомолекулаға байланысты болады; антиген мен антитело, фермент пен субстрат, рецептор мен лиганд, немесе белок пен нуклеин қышқылының байланысы әртүрлі биомолекулаларды оқшаулау үшін жиі қолданылады. Аффиниттік хроматография басқа хроматографиялық әдістермен салыстырғанда жоғары селективтілікке және бөлу дәлдігіне ие.

Топтық және бағандық орнату

Қатты фазаға байланыстыру бағаналы хроматография арқылы жүзеге асырылуы мүмкін, онда қатты орта бағанаға салынады, бастапқы қоспа тұну үшін бағана арқылы өткізіледі, сосын бағана жуу буферімен шайылады және элюция буфері бағанаға қолданылып жиналады. Бұл қадамдар әдетте атмосфералық қысымда орындалады. Бағанға қоспамен өңдеу арқылы да байланыстыруға қол жеткізуге болады, мысалы, бастапқы қоспаны ыдыстағы қатты фазаға қосып, араластырып, қатты фазаны бөліп, сұйық фазаны алып тастап, жуып, қайта центрифугалап, элюция буферін қосып, қайта центрифугалап және элюатты алып тастау арқылы. Кейде гибридтік әдіс қолданылады, яғни байланыстыру бағанға қоспамен жасалады, бірақ мақсатты молекула байланысқан қатты фаза бағанаға салынып, бағанада жуу және элюция жүргізіледі. Аффиниттік хроматографияда қолданылатын лигандтар органикалық және бейорганикалық көздерден алынады. Биологиялық көздерге сарысу ақуыздары, лектиндер және антиденелер жатады. Бейорганикалық көздерге морон қышқылы, металл хелаттары және триазин бояғыштары жатады. Жоғарыда аталған екі әдістің артықшылықтарын біріктіретін үшінші әдіс – кеңейтілген төсек сіңіруі де әзірленді. Қатты фаза бөлшектері бағанаға салынады, онда сұйық фаза төменнен сорылып, жоғарыдан шығады. Бөлшектердің гравитациясы қатты фазаның сұйық фазамен бірге бағанадан шықпауын қамтамасыз етеді. Аффиниттік бағаналарды тұз концентрациясын, pH, pI, зарядты және иондық күшті тікелей өзгерту арқылы немесе қызығушылық тудыратын бөлшектерді бөлу үшін градиент арқылы элюциялауға болады. Жақында бірнеше бағаннан тұратын жүйелер құрастырылды. Бір бағанды жүйелермен салыстырғандағы артықшылығы – байланыспайтын өнім тікелей келесі бағанға, жаңа материалмен бірге беріледі, сондықтан шығару материалдары толық жүктеледі. Бұл хроматографиялық процестер мерзімдік кері ағымдық хроматография (PCC) деп аталады. Осылайша, өндірілген өнімге шаққандағы шығару материалдарының шығыны күрт төмендеді. Бір бағанды әрқашан элюциялап және жаңартуға болады, ал екінші бағана жүктеліп тұрғандықтан, артықшылықтарды толық пайдалану үшін екі баған жеткілікті. Қосымша бағаналар элюция және жаңарту уақытына қосымша икемділік береді, бірақ бұл қосымша жабдықтар мен шығару материалдарының шығынына әкеледі.

Binding to the solid phase may be achieved by column chromatography whereby the solid medium is packed onto a column, the initial mixture run through the column to allow settling, a wash buffer run through the column and the elution buffer subsequently applied to the column and collected. These steps are usually done at ambient pressure. Alternatively, binding may be achieved using a batch treatment, for example, by adding the initial mixture to the solid phase in a vessel, mixing, separating the solid phase, removing the liquid phase, washing, re centrifuging, adding the elution buffer, re centrifuging and removing the elute. Sometimes a hybrid method is employed such that the binding is done by the batch method, but the solid phase with the target molecule bound is packed onto a column and washing and elution are done on the column. The ligands used in affinity chromatography are obtained from both organic and inorganic sources. Examples of biological sources are serum proteins, lectins and antibodies. Inorganic sources are moronic acid, metal chelates and triazine dyes. A third method, expanded bed absorption, which combines the advantages of the two methods mentioned above, has also been developed. The solid phase particles are placed in a column where liquid phase is pumped in from the bottom and exits at the top. The gravity of the particles ensure that the solid phase does not exit the column with the liquid phase. Affinity columns can be eluted by changing salt concentrations, pH, pI, charge and ionic strength directly or through a gradient to resolve the particles of interest. More recently, setups employing more than one column in series have been developed. The advantage compared to single column setups is that the resin material can be fully loaded since non binding product is directly passed on to a consecutive column with fresh column material. These chromatographic processes are known as periodic counter current chromatography (PCC). The resin costs per amount of produced product can thus be drastically reduced. Since one column can always be eluted and regenerated while the other column is loaded, already two columns are sufficient to make full use of the advantages. Additional columns can give additional flexibility for elution and regeneration times, at the cost of additional equipment and resin costs.

Арнайы пайдалану

Афинитеттік хроматографияны көптеген қолданыстарда пайдалануға болады, оның ішінде нуклеин қышқылын тазарту, жасушасыз сыртқы ортадан ақуыздарды тазарту және қаннан тазарту. Афинитеттік хроматография арқылы белгілі бір фрагментке байланысатын ақуыздарды, сол фрагментке байланыспайтын ақуыздардан бөліп алуға болады. Бұл тазарту әдісі қажетті ақуыздың биологиялық қасиеттеріне негізделгендіктен, тиімді әдіс болып табылады және бір қадамда ақуыздарды көп есеге тазартуға мүмкіндік береді.

Түрлі аффинатты орта

Көптеген түрлі аффиниттік орталар әртүрлі қолдану мүмкіндіктері үшін бар. Қысқаша айтқанда, олар (жалпыланған) белсендірілген/функционалды, функционалды аралық, қолдау матрицасы ретінде жұмыс істейді және улы реагенттерді қолдануды болдырмайды. Аминқышқылдық орта әртүрлі сарысу белоктарымен, белоктармен, пептидтермен және ферменттермен, сондай-ақ рРНК және қос спиральды ДНК (dsDNA) -мен қолданылады. Авидин-биотиндік орта биотинді/авидинді және олардың туындыларын тазарту процесінде қолданылады. Көмірсутекті байланыстыру көбінесе гликопротеиндермен немесе кез келген көмірсутек қамтитын заттармен қолданылады; көмірсутек лектиндермен, гликопротеиндермен немесе кез келген көмірсутек метаболиті ақуызымен қолданылады. Бояғыш лигандтық орта арнайы емес, бірақ биологиялық субстраттар мен ақуыздарды имитациялайды. Глутатион GST таңбаланған рекомбинантты ақуыздарды бөлуге пайдалы. Гепарин жалпыланған аффиниттік лиганд болып табылады және плазмадағы қан ұю протеиндерін, нуклеин қышқылы ферменттерін және липазаларды бөлу үшін өте пайдалы. Гидрофобты өзара әрекеттесу орталары көбінесе бос карбоксил топтары мен ақуыздарды анықтау үшін қолданылады. Иммуноаффиниттік орта (төменде егжей-тегжейлі сипатталған) антигендер мен антиденелердің жоғары ерекшелігін пайдаланып бөлуге мүмкіндік береді; жылжымайтын металл аффиниттік хроматографиясы төменде егжей-тегжейлі сипатталады және металл иондары мен ақуыздар (әдетте арнайы таңбаланған) арасындағы өзара әрекеттесулерді пайдаланып бөлуге қолданылады; нуклеотид/коэнзим дегидрогеназаларды, киназаларды және трансаминазаларды бөлу үшін жұмыс істейді. Нуклеин қышқылы мРНК, ДНК, рРНК және басқа нуклеин қышқылы/олигонуклеотидтерді ұстауға қызмет етеді. А/Г ақуыз әдісі иммуноглобулиндерді тазарту үшін қолданылады. Арнайы орталар белгілі бір классқа немесе ақуыз/кофермент түріне арналған; осы типтегі орта тек белгілі бір ақуызды немесе коферментті бөлу үшін жұмыс істейді.

Иммуноафинитет

Процедураның тағы бір қолданылуы – қан сарысуынан антиденелерді аффиндік тазалау. Егер сарысуда белгілі бір антигенге қарсы антиденелер бар екені белгілі болса (мысалы, сарысу тиісті антигенге қарсы иммундалған организмнен алынған болса), онда оны осы антигеннің аффиндік тазалауы үшін пайдалануға болады. Бұл иммуноаффиниттік хроматография деп те аталады. Мысалы, егер организм GST біріктірілген ақуызына қарсы иммунизацияланса, ол біріктірілген ақуызға қарсы антиденелерді, сондай-ақ GST белгісіне қарсы антиденелерді де өндіреді. Ақуызды кейін агароза сияқты қатты тірекке ковалентті түрде байланыстырып, иммундық сарысудан антиденелерді тазартуда аффиндік лиганд ретінде пайдалануға болады. Толықтығын арттыру үшін GST ақуызы мен GST біріктірілген ақуызының әрқайсысын жеке байланыстыруға болады. Алдымен сарысудың GST аффиниттік матрицасына байланысуына рұқсат етіледі. Бұл біріктірілген ақуыздың GST бөлігіне қарсы антиденелерді жояды. Содан кейін сарысу қатты тіректен бөлініп, GST біріктірілген ақуыз матрицасына байланысуға рұқсат етіледі. Бұл антигенді танитын кез келген антиденені қатты тірекке түсіруге мүмкіндік береді. Қажетті антиденелерді элюциялау көбінесе төмен pH буфері, мысалы, глицин pH 2.8 көмегімен жүзеге асырылады. Элюат бейтарап трис немесе фосфат буферіне жиналады, төмен pH-ты элюция буферін бейтараптандыру және антидене белсенділігінің ыдырауын тоқтату үшін. Бұл жақсы мысал, себебі аффиндік тазалау бастапқы GST біріктірілген ақуызын тазарту үшін, сарысудан GST-ге қарсы антиденелерді жою үшін және мақсатты антиденелерді тазарту үшін қолданылады. Моноклоналды антиденелерді де протеиндермен жоғары ерекшелікпен байланысу үшін таңдауға болады, онда протеиндер өте жұмсақ жағдайларда босатылады. Бұл болашақтағы зерттеулерге пайдалы болуы мүмкін. Пептид антигендеріне қарсы туындаған антиденелерді тазарту үшін көбінесе жеңілдетілген стратегия қолданылады. Пептид антигендері синтетикалық жолмен өндірілгенде, пептидтің N немесе C шетінде цистеиннің соңғы қалдығы қосылады. Бұл цистеин қалдығында сульфгидрил функционалдық тобы бар, ол пептидті тасымалдаушы ақуызға (мысалы, кілт тесігі лимпеті гемоцианиніне (KLH)) оңай конъюгациялауға мүмкіндік береді. Сол цистеин қалдығын қамтитын пептид цистеин қалдығы арқылы агароза шайырына бекітіліп, антиденені тазарту үшін қолданылады. Көптеген моноклоналды антиденелер бактериялардан алынған иммуноглобулиндік А немесе G ақуыздарына негізделген аффиниттік хроматография арқылы тазартылды. Монолиттік бағанада бекітілген моноклоналды антиденелермен иммуноаффиниттік хроматография адам қан плазмасынан тетраспаниндер мен интеграндардың бетінде кездесетін экзосомалар мен экзомерлерді (мысалы, экзосомалар мен экзомерлерді) алу үшін сәтті қолданылды. Иммуноаффиниттік хроматография иммунохроматографиялық тест (ИХТ) таспаларының негізі болып табылады, ол пациенттерді емдеуде жылдам диагностикалау құралын қамтамасыз етеді. ИХТ-ны қолдану арқылы техник науқастың жанында, зертханаға бармастан оның жағдайын анықтай алады. ИХТ анықтамасы инфекцияны тудыратын микробқа өте ерекше.

Another use for the procedure is the affinity purification of antibodies from blood serum. If the serum is known to contain antibodies against a specific antigen (for example if the serum comes from an organism immunized against the antigen concerned) then it can be used for the affinity purification of that antigen. This is also known as Immunoaffinity Chromatography. For example, if an organism is immunised against a GST fusion protein it will produce antibodies against the fusion protein, and possibly antibodies against the GST tag as well. The protein can then be covalently coupled to a solid support such as agarose and used as an affinity ligand in purifications of antibody from immune serum. For thoroughness, the GST protein and the GST fusion protein can each be coupled separately. The serum is initially allowed to bind to the GST affinity matrix. This will remove antibodies against the GST part of the fusion protein. The serum is then separated from the solid support and allowed to bind to the GST fusion protein matrix. This allows any antibodies that recognize the antigen to be captured on the solid support. Elution of the antibodies of interest is most often achieved using a low pH buffer such as glycine pH 2.8. The eluate is collected into a neutral tris or phosphate buffer, to neutralize the low pH elution buffer and halt any degradation of the antibody's activity. This is a nice example as affinity purification is used to purify the initial GST fusion protein, to remove the undesirable anti GST antibodies from the serum and to purify the target antibody. Monoclonal antibodies can also be selected to bind proteins with great specificity, where protein is released under fairly gentle conditions. This can become of use for further research in the future. A simplified strategy is often employed to purify antibodies generated against peptide antigens. When the peptide antigens are produced synthetically, a terminal cysteine residue is added at either the N or C terminus of the peptide. This cysteine residue contains a sulfhydryl functional group which allows the peptide to be easily conjugated to a carrier protein (e. g. Keyhole limpet hemocyanin (KLH)). The same cysteine containing peptide is also immobilized onto an agarose resin through the cysteine residue and is then used to purify the antibody. Most monoclonal antibodies have been purified using affinity chromatography based on immunoglobulin specific Protein A or Protein G, derived from bacteria. Immunoaffinity chromatography with monoclonal antibodies immobilized on monolithic column has been successfully used to capture extracellular vesicles (e. g., exosomes and exomeres) from human blood plasma by targeting tetraspanins and integrins found on the surface of the EVs. Immunoaffinity chromatography is also the basis for immunochromatographic test (ICT) strips, which provide a rapid means of diagnosis in patient care. Using ICT, a technician can make a determination at a patient's bedside, without the need for a laboratory. ICT detection is highly specific to the microbe causing an infection.

Қозғалмайтын металл иондарының аффинатты хроматографиясы

Иммобилизацияланған металл иондарының аффинитеттік хроматографиясы (IMAC) аминқышқылдарының, әсіресе гистидиннің, металдармен нақты координациялық коваленттік байланысына негізделген. Бұл техника металл иондарына жақындығы бар белоктарды, мысалы кобальт, никель немесе мыс – гистидин қышқылдарын қамтитын белоктар немесе пептидтерді тазарту үшін, немесе темір, мырыш немесе галлий – фосфорланған белоктар немесе пептидтерді тазарту үшін, иммобилизацияланған металл иондары бар бағанада ұстау арқылы жұмыс істейді. Көптеген табиғи белоктар металл иондарына жақындық танытпайды, сондықтан рекомбинантты ДНҚ технологиясы осындай белок таңбасын тиісті генге енгізу үшін қолданылуы мүмкін. Қызығушылық тудыратын белокты алу үшін қолданылатын әдістерге pH-ты өзгерту немесе имидазол сияқты бәсекелес молекулаларды қосу жатады.

Рекомбинантты ақуыздар

Мүмкін, аффиниттік хроматографияның ең көп қолданылатын түрі – рекомбинантты ақуыздарды тазарту. Белгілі бір аффиниттіге ие ақуыздарды тазалауды жеңілдету үшін оларға белок таңбасы қойылады. Ақуыз генетикалық түрде өзгертілген болуы мүмкін, осылайша оны аффиниттік байланысқа іріктеуге болады; мұндай ақуыз – қосымша ақуыз деп аталады. Белок таңбаларына гексагистидин (His), глутатион S трансферазасы (GST), мальтоза байланыстыратын ақуыз (MBP) және Colicin E7-нің CL7 таңбасы жатады. Гистидин таңбалары стационарлық фазаға енгізілген хелатормен координациялық ковалентті байланыстар арқылы бекітілген никель, кобальт, мырыш, мыс және темір иондарына аффинитті болады. Элюция үшін металл ионының лиганд ретінде әрекет ете алатын, мысалы, имидазол сияқты қосылыстың артық мөлшері қолданылады. GST глутатионға аффинитті, ол коммерциялық түрде глутатион агарозасы ретінде бекітілген күйде қол жетімді. Элюция кезінде артық глутатион таңбаланған ақуызды ығыстыру үшін қолданылады. CL7 Иммунитет протеині 7 (Im7) үшін аффиниттілікке және спецификалық қасиеттерге ие, ол коммерциялық түрде Im7 агароза шайыры ретінде бекітілген. Элюция үшін Im7 шайырына белсенді және нақтылы протеаза қолданылып, таңбасы жоқ ақуыз босатылады.

Лектиндер

Лектиндік аффинаттық хроматография – аффинаттық хроматографияның бір түрі, онда лектиндер сынамадағы компоненттерді бөлу үшін пайдаланылады. Конканавалин А сияқты лектиндер – белгілі бір альфа-D манноза және альфа-D глюкоза көмірсу молекулаларын байланыстыра алатын ақуыздар. Лектиндік аффинаттық хроматографияда қолданылатын кең таралған көмірсу молекулалары – Con A Sepharose және WGA агароза. Лектиннің тағы бір мысалы – Д-N-ацетилглюкозаминмен байланысатын бидай тұқымының агглютинині. Оның ең көп қолданылатын саласы – гликопротеиндерді гликозильденбеген ақуыздардан немесе бір гликоформаны екінші гликоформадан бөлу. Лектиндік аффинаттық хроматографияны жүргізудің әртүрлі тәсілдері болғанымен, мақсаты – қажетті ақуыздың қант лиганын алу болып табылады.

Қаттылық

E. coli бактериясынан алынған сілтілік фосфатазаны DEAE целлюлозалық матрица қолданып тазартуға болады. А. фосфатазаның шамалы теріс заряды бар, бұл оған матрицадағы оң зарядталған амин топтарына нашар байланысуға мүмкіндік береді. Ферментті жоғары тұз концентрациясы бар буфер қосып элюциялауға болады.

Боронат жұптық хроматографиясы

Боронат жұптық хроматографиясы гликопротеиндердің мөлшерін бөліп алу және сандық анықтау үшін бор қышқылы немесе боронаттарды қолданудан тұрады. Клиникалық қолданыстар бұл хроматография түрін қант диабетімен ауыратын науқастардың гликозды гемоглобинін талдау арқылы олардың жағдайын ұзақ мерзімді бағалау үшін пайдаланады.

Әлсіз аффинатты хроматография

Әлсіз аффинитті хроматография (WAC) – дәрі-дәрмектерді әзірлеуде аффиниттік скринингті жүргізуге арналған аффиниттік хроматография техникасы. WAC – иммобильдік нысанаға қатысты химиялық қосылыстардың әртүрлі нашар аффиниттігіне негізделген, аффиниттік негіздегі сұйық хроматографиялық техника. Қосылыстың нысанаға деген аффиниттігі жоғары болған сайын, ол бөлу құрылымында соғұрлым ұзақ уақыт қалады, бұл ұзақ уақытқа сақталу ретінде көрінеді. Аффиниттікті өлшеу және аффиниттілік бойынша жіктеу, талданған қосылыстардың алынған сақталу уақыттарын өңдеу арқылы жүзеге асырылуы мүмкін. Аффиниттік хроматография – химопротеомикалық негіздегі дәрілік нысандарды анықтау үшін қолданылатын техникалардың кең спектрінің бір бөлігі. WAC технологиясы түрлі белок нысандарына қарсы қолданылды – протеаздар, киназалар, шаперондар және белок-белок өзара әрекеттесу (PPI) нысандары. WAC фрагменттерге негізделген скрининг үшін белгілі әдістерден тиімдірек екені көрсетілді.