Аффинная хроматография: методы и применение для очистки биомолекул.

Введение

Техника очистки биомолекул

Аффинная хроматография – это метод разделения биомолекулы из смеси, основанный на высокоспецифичном макромолекулярном взаимодействии между биомолекулой и другим веществом. Конкретный тип взаимодействия зависит от целевой биомолекулы; для выделения различных биомолекул часто используют взаимодействия антиген-антитело, фермент-субстрат, рецептор-лиганд или белок-нуклеиновая кислота. Аффинная хроматография отличается высокой селективностью и разрешающей способностью разделения по сравнению с другими хроматографическими методами.

Настройка партий и колонн

Связывание с твердой фазой может быть достигнуто с помощью колоночной хроматографии, при которой твердая среда упаковывается в колонку, исходная смесь пропускается через колонку для осаждения, затем через колонку пропускается промывочный буфер, а буфер элюирования последовательно наносится на колонку и собирается. Эти этапы обычно выполняются при атмосферном давлении. Альтернативно, связывание может быть осуществлено методом обработки в растворе, например, путем добавления исходной смеси к твердой фазе в сосуде, перемешивания, разделения твердой фазы, удаления жидкой фазы, промывки, повторной центрифугирования, добавления элюирующего буфера, повторной центрифугирования и удаления элюата. Иногда используется гибридный метод, при котором связывание проводится методом обработки в растворе, но твердая фаза с привязанной целевой молекулой упаковывается в колонку, а промывка и элюирование проводятся на колонке. Лиганды, используемые в аффинной хроматографии, получают как из органических, так и из неорганических источников. Примерами биологических источников являются сывороточные белки, лектины и антитела. Неорганическими источниками являются моровая кислота, хелаты металлов и триазиновые красители. Также был разработан третий метод – хроматография с расширенным слоем, который сочетает преимущества двух вышеупомянутых методов. Частицы твердой фазы помещаются в колонку, в которую жидкая фаза подается снизу и выходит сверху. Гравитация частиц обеспечивает, чтобы твердая фаза не вымывалась из колонки вместе с жидкой фазой. Аффинные колонки могут элюироваться путем изменения концентрации соли, pH, изоэлектрической точки, заряда и ионной силы непосредственно или с использованием градиента для разделения целевых частиц. В последнее время были разработаны системы, использующие более одной колонки последовательно. Преимущество по сравнению с системами с одной колонкой заключается в том, что смола может быть полностью загружена, поскольку продукт, не связывающийся с лигандом, непосредственно направляется в следующую колонку со свежим материалом. Эти хроматографические процессы известны как периодическая противоточная хроматография (ППХ). Таким образом, стоимость смолы на единицу произведенного продукта может быть значительно снижена. Поскольку одну колонку всегда можно элюировать и регенерировать, в то время как другая колонна загружается, уже двух колонок достаточно для полной реализации преимуществ. Дополнительные колонки могут обеспечить дополнительную гибкость в отношении времени элюирования и регенерации, но требуют дополнительного оборудования и затрат на смолу.

Binding to the solid phase may be achieved by column chromatography whereby the solid medium is packed onto a column, the initial mixture run through the column to allow settling, a wash buffer run through the column and the elution buffer subsequently applied to the column and collected. These steps are usually done at ambient pressure. Alternatively, binding may be achieved using a batch treatment, for example, by adding the initial mixture to the solid phase in a vessel, mixing, separating the solid phase, removing the liquid phase, washing, re centrifuging, adding the elution buffer, re centrifuging and removing the elute. Sometimes a hybrid method is employed such that the binding is done by the batch method, but the solid phase with the target molecule bound is packed onto a column and washing and elution are done on the column. The ligands used in affinity chromatography are obtained from both organic and inorganic sources. Examples of biological sources are serum proteins, lectins and antibodies. Inorganic sources are moronic acid, metal chelates and triazine dyes. A third method, expanded bed absorption, which combines the advantages of the two methods mentioned above, has also been developed. The solid phase particles are placed in a column where liquid phase is pumped in from the bottom and exits at the top. The gravity of the particles ensure that the solid phase does not exit the column with the liquid phase. Affinity columns can be eluted by changing salt concentrations, pH, pI, charge and ionic strength directly or through a gradient to resolve the particles of interest. More recently, setups employing more than one column in series have been developed. The advantage compared to single column setups is that the resin material can be fully loaded since non binding product is directly passed on to a consecutive column with fresh column material. These chromatographic processes are known as periodic counter current chromatography (PCC). The resin costs per amount of produced product can thus be drastically reduced. Since one column can always be eluted and regenerated while the other column is loaded, already two columns are sufficient to make full use of the advantages. Additional columns can give additional flexibility for elution and regeneration times, at the cost of additional equipment and resin costs.

Особое применение

Аффинная хроматография может использоваться в различных областях, включая очистку нуклеиновых кислот, очистку белков из безклеточных экстрактов и очистку из крови. С помощью аффинной хроматографии можно разделить белки, связывающиеся с определенным фрагментом, от белков, которые с этим фрагментом не связываются. Поскольку этот метод очистки основан на биологических свойствах целевого белка, он является эффективным, и белки могут быть очищены в десятки или сотни раз за один этап.

Различные афинитетные среды

Существует множество различных аффинных сорбентов для широкого спектра применений. Вкратце, они (в общем виде) активированы/функционализированы и выполняют роль функционального спейсера, поддерживающей матрицы, а также позволяют избежать работы с токсичными реагентами. Аминокислотные сорбенты используются с различными сывороточными белками, белками, пептидами и ферментами, а также с рРНК и двуцепочечной ДНК. Авидин-биотин сорбенты применяются в процессе очистки биотина/авидина и их производных. Углеводное связывание чаще всего используется с гликопротеинами или любыми другими веществами, содержащими углеводы; углеводы используются с лектинами, гликопротеинами или любыми другими углеводными метаболитами белков. Сорбенты с красителями-лигандами неспецифичны, но имитируют биологические субстраты и белки. Глутатион полезен для разделения рекомбинантных белков, меченных GST. Гепарин является обобщенным аффинным лигандом и наиболее эффективен для разделения белков плазменной коагуляции, а также ферментов, работающих с нуклеиновыми кислотами и липаз.

Сорбенты для гидрофобного взаимодействия чаще всего используются для выделения соединений, содержащих свободные карбоксильные группы, и белков. Иммуноаффинные сорбенты (описаны ниже) используют высокую специфичность антигенов и антител для разделения; иммобилизованная металл-аффинная хроматография подробно описана ниже и использует взаимодействие между ионами металлов и белками (обычно специально модифицированными) для разделения; нуклеотиды/коферменты используются для разделения дегидрогеназ, киназ и трансаминаз. Нуклеиновые кислоты служат для захвата мРНК, ДНК, рРНК и других нуклеиновых кислот/олигонуклеотидов. Метод белка A/G используется для очистки иммуноглобулинов. Специализированные сорбенты предназначены для конкретного класса или типа белков/коферментов; этот тип сорбента будет работать только для разделения определенного белка или кофермента.

Иммуноафинитет

Еще одно применение процедуры – аффинная очистка антител из сыворотки крови. Если известно, что сыворотка содержит антитела против специфического антигена (например, если сыворотка получена от организма, иммунизированного против данного антигена), то ее можно использовать для аффинной очистки этого антигена. Это также известно как иммуноаффинная хроматография. Например, если организм иммунизирован против GST-белка-слияния, он будет продуцировать антитела против белка-слияния и, возможно, антитела против GST-тега. Затем белок можно ковалентно связать с твердым носителем, таким как агароза, и использовать в качестве аффинного лиганда при очистке антител из иммунной сыворотки. Для большей тщательности белок GST и GST-белок-слияние могут быть соединены раздельно. Сначала сыворотке дают возможность связаться с аффинной матрицей GST. Это удалит антитела против GST-части белка-слияния. Затем сыворотку отделяют от твердого носителя и дают возможность связаться с матрицей GST-белка-слияния. Это позволяет захватить на твердом носителе любые антитела, распознающие антиген. Элюция интересующих антител чаще всего достигается с использованием буфера с низким pH, например, глицина pH 2,8. Элюат собирают в нейтральный трис- или фосфатный буфер для нейтрализации элюирующего буфера с низким pH и предотвращения деградации активности антитела. Это хороший пример, поскольку аффинная очистка используется для очистки исходного GST-белка-слияния, удаления нежелательных анти-GST антител из сыворотки и очистки целевого антитела. Моноклональные антитела также могут быть отобраны для связывания белков с высокой специфичностью, при этом белок высвобождается в довольно мягких условиях. Это может быть полезно для дальнейших исследований в будущем. Для очистки антител, полученных против пептидных антигенов, часто используется упрощенная стратегия. При синтезе пептидных антигенов к N- или C-концу пептида добавляется концевой остаток цистеина. Этот остаток цистеина содержит сульфгидрильную функциональную группу, которая позволяет легко конъюгировать пептид с белком-носителем (например, гемоцианином морского гребешка (KLH)). Тот же пептид, содержащий цистеин, также иммобилизуется на агарозной смоле через остаток цистеина и затем используется для очистки антитела. Большинство моноклональных антител очищались с помощью аффинной хроматографии на основе белка A или белка G, специфичных для иммуноглобулинов, полученных из бактерий. Иммуноаффинная хроматография с моноклональными антителами, иммобилизованными на монолитной колонке, успешно использовалась для выделения внеклеточных везикул (например, экзосом и экзомеров) из плазмы крови человека путем нацеливания на тетраспанины и интеграны, обнаруженные на поверхности EV. Иммуноаффинная хроматография также лежит в основе иммунохроматографических тест-полосок (ИХТ), которые обеспечивают быстрый способ диагностики в медицинской практике. Используя ИХТ, техник может сделать заключение у постели пациента, без необходимости в лаборатории. Обнаружение с помощью ИХТ обладает высокой специфичностью к микробу, вызывающему инфекцию.

Another use for the procedure is the affinity purification of antibodies from blood serum. If the serum is known to contain antibodies against a specific antigen (for example if the serum comes from an organism immunized against the antigen concerned) then it can be used for the affinity purification of that antigen. This is also known as Immunoaffinity Chromatography. For example, if an organism is immunised against a GST fusion protein it will produce antibodies against the fusion protein, and possibly antibodies against the GST tag as well. The protein can then be covalently coupled to a solid support such as agarose and used as an affinity ligand in purifications of antibody from immune serum. For thoroughness, the GST protein and the GST fusion protein can each be coupled separately. The serum is initially allowed to bind to the GST affinity matrix. This will remove antibodies against the GST part of the fusion protein. The serum is then separated from the solid support and allowed to bind to the GST fusion protein matrix. This allows any antibodies that recognize the antigen to be captured on the solid support. Elution of the antibodies of interest is most often achieved using a low pH buffer such as glycine pH 2.8. The eluate is collected into a neutral tris or phosphate buffer, to neutralize the low pH elution buffer and halt any degradation of the antibody's activity. This is a nice example as affinity purification is used to purify the initial GST fusion protein, to remove the undesirable anti GST antibodies from the serum and to purify the target antibody. Monoclonal antibodies can also be selected to bind proteins with great specificity, where protein is released under fairly gentle conditions. This can become of use for further research in the future. A simplified strategy is often employed to purify antibodies generated against peptide antigens. When the peptide antigens are produced synthetically, a terminal cysteine residue is added at either the N or C terminus of the peptide. This cysteine residue contains a sulfhydryl functional group which allows the peptide to be easily conjugated to a carrier protein (e. g. Keyhole limpet hemocyanin (KLH)). The same cysteine containing peptide is also immobilized onto an agarose resin through the cysteine residue and is then used to purify the antibody. Most monoclonal antibodies have been purified using affinity chromatography based on immunoglobulin specific Protein A or Protein G, derived from bacteria. Immunoaffinity chromatography with monoclonal antibodies immobilized on monolithic column has been successfully used to capture extracellular vesicles (e. g., exosomes and exomeres) from human blood plasma by targeting tetraspanins and integrins found on the surface of the EVs. Immunoaffinity chromatography is also the basis for immunochromatographic test (ICT) strips, which provide a rapid means of diagnosis in patient care. Using ICT, a technician can make a determination at a patient's bedside, without the need for a laboratory. ICT detection is highly specific to the microbe causing an infection.

Хроматография аффинности иммобилированных ионов металлов

Иммобилизованная металл-аффинная хроматография (IMAC) основана на специфической координационно-ковалентной связи аминокислот, особенно гистидина, с металлами. Эта методика работает путем удержания белков, обладающих аффинностью к ионам металлов, в колонке, содержащей иммобилизованные ионы металлов, такие как кобальт, никель или медь, для очистки белков или пептидов, содержащих гистидин, а также железо, цинк или галлий для очистки фосфорилированных белков или пептидов. Многие природные белки не имеют аффинности к ионам металлов, поэтому технология рекомбинантной ДНК может быть использована для введения такого белкового тега в соответствующий ген. Методы, используемые для элюирования целевого белка, включают изменение pH или добавление конкурентного соединения, например, имидазола.

Рекомбинантные белки

Возможно, наиболее распространенное применение аффинной хроматографии – очистка рекомбинантных белков. Белки с известным аффинитетом маркируют для облегчения их очистки. Белок может быть генетически модифицирован, чтобы обеспечить его селективное связывание в аффинной хроматографии; это известно как белок-слияние. К белковым меткам относятся гексагистидин (His), глутатион-S-трансфераза (GST), белок, связывающий мальтозу (MBP), и метка CL7, вариант Colicin E7. Гистидиновые метки проявляют аффинность к ионам никеля, кобальта, цинка, меди и железа, которые иммобилизуются посредством образования координационных ковалентных связей с хелатором, включенным в стационарную фазу. Для элюирования используют избыток соединения, способного выступать в качестве лиганда ионов металла, например, имидазола. GST обладает аффинностью к глутатиону, который коммерчески доступен в иммобилизованной форме в виде глутатион-агарозы. В процессе элюирования избыток глутатиона используется для вытеснения меченого белка. CL7 имеет аффинность и специфичность к Иммунитетному белку 7 (Im7), который коммерчески доступен в иммобилизованной форме в виде смолы агарозы Im7. Для элюирования на смолу Im7 наносят активную протеазу, специфичную к определенному участку, для высвобождения белка без метки.

Лектины

Лектинная аффинная хроматография – это разновидность аффинной хроматографии, в которой лектины используются для разделения компонентов в образце. Лектины, такие как конканавалин А, – это белки, способные связывать специфические молекулы углеводов, альфа-D-маннозу и альфа-D-глюкозу. Некоторые распространенные углеводные матрицы, используемые в лектинной аффинной хроматографии, – это Con A Sepharose и WGA-агароза. Другим примером лектина является агглютинин зародышей пшеницы, который связывает D-N-ацетилглюкозамин. Наиболее распространенное применение – разделение гликопротеинов от негликозилированных белков или одной гликоформы от другой. Несмотря на различные способы проведения лектинной аффинной хроматографии, цель состоит в выделении сахарного лиганда целевого белка.

Алкальная фосфатаза

Алкальную фосфатазу из E. coli можно очистить с помощью DEAE-целлюлозной матрицы. Алкальная фосфатаза имеет небольшой отрицательный заряд, что позволяет ей слабо связываться с положительно заряженными аминогруппами в матрице. Затем фермент можно элюировать, добавив буфер с более высокой концентрацией соли.

Боронатная аффинити-хроматография

Боронатная аффинная хроматография основана на использовании борной кислоты или боратов для элюирования и количественного определения гликопротеинов. В клинической практике этот тип хроматографии применяется для долгосрочного мониторинга состояния пациентов с диабетом посредством анализа гликированного гемоглобина.

Хроматография слабой аффинитета

Хроматография слабой аффинности (WAC) – это метод аффинной хроматографии, используемый для скрининга аффинности в разработке лекарственных препаратов. WAC представляет собой жидкохроматографический метод, основанный на аффинности, который разделяет химические соединения в зависимости от их различной слабой аффинности к иммобилизованной мишени. Чем выше аффинность соединения к мишени, тем дольше оно задерживается в системе разделения, что проявляется в большем времени удержания. Оценка и ранжирование аффинности достигаются путем обработки полученных времен удержания анализируемых соединений. Аффинная хроматография входит в состав более широкого комплекса методов, применяемых для идентификации мишеней лекарственных препаратов на основе химиопротеомики. Технология WAC была продемонстрирована на ряде различных белковых мишеней – протеазах, киназах, шаперонах и мишенях, связанных с белок-белковыми взаимодействиями (PPI). Показано, что WAC более эффективен, чем общепринятые методы фрагментного скрининга.