Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
ДНҚ тізбектеу әдісі
DNA sequencing method
Primer walking – белгілі генді (мысалы, ауру тудыратын генді) оның ең жақын маркерлерінен (мысалы, белгілі ген) клондау үшін қолданылатын техника. Осының нәтижесінде, бұл техника өсімдіктерде, саңырауқұлақтарда және сүтқоректілерде клондау және тізбектеу жұмыстарында аз өзгерістермен қолданылады. Бұл техника "бағытталған тізбектеу" деп те аталады, ол белгілі плазмидтің немесе ПТР өнімінің эталондық тізбесін эталондық тізбекке сәйкес растау (тізбекті растау қызметі) үшін немесе толық плазмидтің немесе ПТР өнімінің белгісіз тізбесін біріне-бірі жапсарлас бөлімдерді тізбектеу үшін примиерлерді жобалау арқылы анықтау (тізбекті анықтау қызметі) үшін Сангер тізбектеу реакцияларының сериясын қолданады.
Primer walking is a technique used to clone a gene (e. g., disease gene) from its known closest markers (e. g., known gene). As a result, it is employed in cloning and sequencing efforts in plants, fungi, and mammals with minor alterations. This technique, also known as "directed sequencing," employs a series of Sanger sequencing reactions to either confirm the reference sequence of a known plasmid or PCR product based on the reference sequence (sequence confirmation service) or to discover the unknown sequence of a full plasmid or PCR product by designing primers to sequence overlapping sections (sequence discovery service).
"Праймерлік жүріс": ДНК тізбектеу әдісі
Праймерлік жүру – 1,3–7,0 кб дейінгі ДНК тізбегін анықтау әдісі, ал хромосомалық жүру – геннің бұрыннан белгілі тізбектерінің клондарын жасау үшін қолданылады. Тізбекті аяқтау әдісімен бір реттілікте өте ұзын фрагменттерді тізбектеп алу мүмкін емес. Бұл әдіс ұзақ тізбекті бірнеше қысқа тізбектерге бөлу арқылы жұмыс істейді. Зейінге алынған ДНК плазмидтік енгізілім, ПТР өнімі немесе геномды тізбектеу кезіндегі олқылықты көрсететін фрагмент болуы мүмкін. «Праймерлік жүру» термині геномды тізбектеу мақсатында қолданылады. Тізбек белгілі болса, бірақ геннің клоны болмаса, «хромосомалық жүру» термині қолданылады. Мысалы, ауруға байланысты ген тізбекте РFLP сияқты белгілі бір маркерге жақын орналасуы мүмкін. Хромосомалық жүру – белгілі жақын маркерлерінен (мысалы, белгілі ген) генді (мысалы, ауруға байланысты генді) клондауға арналған әдіс, сондықтан өсімдіктерде, саңырауқұлақтарда және жануарларда клондау және тізбектеу жобаларында қолданылады. Басқаша айтқанда, ол картаға түсірілетін геннің жанындағы белгілі бір тізбекті табу, оқшаулау және клондау үшін пайдаланылады. Ірі фрагменттердің кітапханалары, әсіресе бактериялық жасанды хромосома кітапханалары, геномдық жобаларда кеңінен қолданылады. Қажетті колонияны анықтау және нақты клонды таңдау үшін кітапхана алдымен қажетті зондпен тексеріледі. Тексеруден кейін клон зондпен салыстырылады және жапсарлас фрагменттер картаға түсіріледі. Бұл фрагменттер (клондардың 3' немесе 5' ұштарынан алынған қысқа ДНК фрагменттері) жаңа зонд ретінде басқа клондарды анықтау үшін қолданылады. Кітапхана шамамен 96 клондан тұрады және әр клонда әртүрлі енгізілім болады. Бірінші зонд λ1 және λ2-ні жапсарластырады, ал екінші зонд λ2 клондарынан алынған λ3-ні анықтайды, және т.б. Клондардың бағыты клондардың шектеу картасы арқылы анықталады. Осылайша геннің жанындағы жаңа хромосомалық аймақтарды анықтауға болады. Хромосомалық жүру көп уақыт алады, ал генді анықтау үшін хромосомалық қону әдісі таңдалады. Бұл әдіс мутант локусына тікелей байланысты маркерді табуды талап етеді. Фрагмент алдымен қысқа фрагмент ретінде тізбектеледі. Тізбектеу әмбебап праймерлерді немесе арнайы жасалған праймерлерді қолдана отырып, әр екі шетінен жүргізіледі. Бұл алғашқы 1000-ға жуық негізді анықтауға тиіс. Мүшеленген аймақты толық тізбектеу үшін біріктірілген тізбек туралы ақпарат алу үшін жаңа праймерлерді (танылған тізбектің соңғы 20 негізін толықтыратын) жобалау және синтездеу қажет.
Primer walking is a method to determine the sequence of DNA up to the 1.3–7.0 kb range whereas chromosome walking is used to produce the clones of already known sequences of the gene. Too long fragments cannot be sequenced in a single sequence read using the chain termination method. This method works by dividing the long sequence into several consecutive short ones. The DNA of interest may be a plasmid insert, a PCR product or a fragment representing a gap when sequencing a genome. The term "primer walking" is used where the main aim is to sequence the genome. The term "chromosome walking" is used instead when the sequence is known but there is no clone of a gene. For example, the gene for a disease may be located near a specific marker such as an RFLP on the sequence. Chromosome walking is a technique used to clone a gene (e. g., disease gene) from its known closest markers (e. g., known gene) and hence is used in moderate modifications in cloning and sequencing projects in plants, fungi, and animals. To put it another way, it's utilized to find, isolate, and clone a specific sequence existing near the gene to be mapped. Libraries of large fragments, mainly bacterial artificial chromosome libraries, are mostly used in genomic projects. To identify the desired colony and to select a particular clone the library is screened first with a desired probe. After screening, the clone is overlapped with the probe and overlapping fragments are mapped. These fragments are then used as a new probe (short DNA fragments obtained from the 3′ or 5′ ends of clones) to identify other clones. A library approximately consists of 96 clones and each clone contains a different insert. Probe one identifies λ1 and λ2 as it overlaps them Probe two derived from λ2 clones is used to identify λ3, and so on. Orientation of the clones is determined by restriction mapping of the clones. Thus, new chromosomal regions present in the vicinity of a gene could be identified. Chromosome walking is time consuming, and chromosome landing is the method of choice for gene identification. This method necessitates the discovery of a marker that is firmly related to the mutant locus. The fragment is first sequenced as if it were a shorter fragment. Sequencing is performed from each end using either universal primers or specifically designed ones. This should identify the first 1000 or so bases. In order to completely sequence the region of interest, design and synthesis of new primers (complementary to the final 20 bases of the known sequence) is necessary to obtain contiguous sequence information.
Бастапқы жүріс пен мылтық реттілігі
Праймерлік жүру – бағытталған тізбектеудің мысалы, себебі праймер белгілі ДНК аймағынан жасалып, тізбектеуді нақты бағытта жүргізуге арналған. Бағытталған тізбектеуге қарағанда, ДНК-ның шоқ тізбектеуі – тездетілген тізбектеу стратегиясы болып табылады. Геном тізбектеудің «ескі заманнан» қалған әдісі бар. Тізбектеудің негізгі әдісі – Сангер тізбекті тоқтату әдісі, ол қолданылатын құралдарға байланысты 100 мен 1000 негіз жұбы арасындағы оқу ұзындығын қамтамасыз етеді. Бұл ұзын ДНК молекулаларын бөліп, клондап, содан кейін тізбектеу қажеттігін білдіреді. Мүмкін болатын екі әдіс бар. Біріншісі – хромосомалық (немесе праймерлік) жүру деп аталады және ол тізбектің бірінші бөлігін тізбектеуден басталады. Келесі (жалғасқан) тізбек бөлігі бірінші тізбек оқылымының соңына толықтырылатын праймерді пайдаланып тізбектеледі, және т.с.с. Бұл әдіс көп жинақтауды қажет етпейді, бірақ көптеген праймерлер қажет және ол салыстырмалы түрде баяу. Бұл мәселені шешу үшін шоқ тізбектеу әдісі әзірленді. Мұнда ДНК әртүрлі бөліктерге бөлінеді (барлығы бірдей жерде бөлінбейді), клондалады және клондау үшін қолданылатын векторға тән праймерлермен тізбектеледі. Бұл үсті-үстіне келетін тізбектерге әкеледі, оларды компьютерде бірыңғай тізбекке біріктіру қажет. Бұл әдіс тізбектеуді параллельдеуге мүмкіндік береді (бір уақытта көптеген тізбектеу реакцияларын дайындап, оларды жүргізуге болады), бұл процесті әлдеқайда жылдамдатады және тізбекке арналған праймерлердің қажеттілігін жояды. Қиындық – тізбектерді олардың дұрыс ретімен ұйымдастыру, себебі мұндағы үсті-үстіне келулер соншалықты анық емес. Бұл мәселені шешу үшін алғашқы нұсқа жасалады, содан кейін маңызды аймақтар басқа әдістерді, мысалы, праймерлік жүруді қолдана отырып, қайта тізбектеледі.
Primer walking is an example of directed sequencing because the primer is designed from a known region of DNA to guide the sequencing in a specific direction. In contrast to directed sequencing, shotgun sequencing of DNA is a more rapid sequencing strategy. There is a technique from the "old time" of genome sequencing. The underlying method for sequencing is the Sanger chain termination method which can have read lengths between 100 and 1000 basepairs (depending on the instruments used). This means you have to break down longer DNA molecules, clone and subsequently sequence them. There are two methods possible. The first is called chromosome (or primer) walking and starts with sequencing the first piece. The next (contiguous) piece of the sequence is then sequenced using a primer which is complementary to the end of the first sequence read and so on. This technique doesn't require much assembling, but you need a lot of primers and it is relatively slow. To overcome this problem the shotgun sequencing method was developed. Here the DNA is broken into different pieces (not all broken at the same place), cloned and sequenced with primers specific for the vector used for cloning. This leads to overlapping sequences which then have to be assembled into one sequence on the computer. This method allows for the parallelization of the sequencing (you can prepare a lot of sequencing reactions at the same time and run them) which makes the process much faster and also avoids the need for sequence specific primers. The challenge is to organize sequences into their order, as overlaps are not as clear here. To resolve this problem, a first draft is made and then critical regions are resequenced using other techniques such as primer walking.