Введение

Метод секвенирования ДНК. Primer walking – это методика, используемая для клонирования гена (например, гена, вызывающего заболевание) из его ближайших известных маркеров (например, известного гена). Благодаря этому, она применяется в работах по клонированию и секвенированию растений, грибов и млекопитающих с незначительными модификациями. Эта методика, также известная как «направленное секвенирование», использует серию реакций секвенирования по Сэнгеру для подтверждения референсной последовательности известного плазмида или продукта ПЦР на основе референсной последовательности (услуга подтверждения последовательности) или для определения неизвестной последовательности полного плазмида или продукта ПЦР путем разработки праймеров для секвенирования перекрывающихся фрагментов (услуга определения последовательности).

Ходьба по праймеру: метод секвенирования ДНК

Ходьба по праймерам – это метод определения последовательности ДНК в диапазоне от 1,3 до 7,0 кб, в то время как ходьба по хромосомам используется для получения клонов уже известных последовательностей гена. Слишком длинные фрагменты невозможно секвенировать за один проход методом обрыва цепи. Этот метод работает путем разделения длинной последовательности на несколько последовательных коротких фрагментов. Интересующая ДНК может быть плазмидной вставкой, продуктом ПЦР или фрагментом, представляющим собой разрыв при секвенировании генома. Термин «ходьба по праймерам» используется, когда основной целью является секвенирование генома. Термин «ходьба по хромосомам» используется, когда последовательность известна, но клона гена нет. Например, ген, ответственный за заболевание, может располагаться рядом со специфическим маркером, таким как RFLP, на последовательности. Ходьба по хромосомам – это метод, используемый для клонирования гена (например, гена заболевания) от его ближайших известных маркеров (например, известного гена), и поэтому применяется при умеренных модификациях в проектах клонирования и секвенирования у растений, грибов и животных. Иными словами, он используется для поиска, выделения и клонирования конкретной последовательности, расположенной рядом с геном, который необходимо картировать. В геномных проектах в основном используются библиотеки крупных фрагментов, в частности библиотеки бактериальных искусственных хромосом. Для идентификации желаемой колонии и выбора конкретного клона библиотека сначала подвергается скринингу с использованием подходящего зонда. После скрининга клон перекрывают с зондом, и перекрывающиеся фрагменты картируют. Затем эти фрагменты используются в качестве нового зонда (короткие фрагменты ДНК, полученные с 3'- или 5'- концов клонов) для идентификации других клонов. Библиотека обычно состоит примерно из 96 клонов, и каждый клон содержит различную вставку. Зонд один идентифицирует λ1 и λ2, поскольку он с ними перекрывается. Зонд два, полученный из клонов λ2, используется для идентификации λ3, и так далее. Ориентация клонов определяется картированием с помощью рестрикционных ферментов. Таким образом, можно идентифицировать новые хромосомные области, расположенные вблизи гена. Ходьба по хромосомам – трудоемкий процесс, и посадка на хромосому является предпочтительным методом для идентификации генов. Этот метод требует обнаружения маркера, который тесно связан с мутантным локусом. Фрагмент сначала секвенируется, как если бы он был короче. Секвенирование проводится с каждого конца с использованием универсальных праймеров или специально разработанных. Это должно идентифицировать первые 1000 оснований. Для полного секвенирования интересующей области необходимо разработать и синтезировать новые праймеры (комплементарные к последним 20 основаниям известной последовательности), чтобы получить непрерывную информацию о последовательности.

Прогулка по сравнению с дробовиком

Ходьба по праймеру является примером направленного секвенирования, поскольку праймер разрабатывается на основе известного участка ДНК для управления секвенированием в определенном направлении. В отличие от направленного секвенирования, секвенирование дробным методом (shotgun sequencing) ДНК является более быстрой стратегией. Существует метод секвенирования генома, использовавшийся в "старые времена". В основе метода секвенирования лежит метод обрыва цепи Сангера, который может обеспечивать длины прочтений от 100 до 1000 пар оснований (в зависимости от используемого оборудования). Это означает, что более длинные молекулы ДНК необходимо фрагментировать, клонировать и затем секвенировать. Существует два возможных метода. Первый называется хромосомной ходьбой (или ходьбой по праймеру) и начинается с секвенирования первого фрагмента. Следующий (смежный) фрагмент последовательности затем секвенируется с использованием праймера, комплементарного концу первого прочтения, и так далее. Этот метод не требует сложной сборки, но нуждается в большом количестве праймеров и является относительно медленным. Для преодоления этой проблемы был разработан метод секвенирования дробным методом. Здесь ДНК разбивается на различные фрагменты (не все в одном и том же месте), клонируется и секвенируется с использованием праймеров, специфичных для вектора, используемого для клонирования. Это приводит к перекрывающимся последовательностям, которые затем необходимо собрать в единую последовательность с помощью компьютера. Этот метод позволяет проводить секвенирование параллельно (можно одновременно подготовить множество реакций секвенирования и запустить их), что значительно ускоряет процесс и устраняет необходимость в праймерах, специфичных к последовательности. Задача состоит в том, чтобы упорядочить последовательности, поскольку перекрытия здесь не всегда очевидны. Для решения этой проблемы создается первый черновой вариант, а затем критические области повторно секвенируются с использованием других методов, таких как ходьба по праймеру.