Молекулалық өлшем бойынша хроматографиялық бөлу әдісі

Кіріспе

Ерітілген молекулаларды олардың мөлшері және молекулалық салмағы бойынша бөлетін хроматографиялық әдіс.

Мөлшерін алып тастау хроматографиясы, сондай-ақ молекулалық ішек хроматографиясы деп аталатын бұл әдіс, ерітіндідегі молекулаларды олардың көлемі және кейбір жағдайларда молекулалық салмағы бойынша бөледі. Ол көбінесе ақуыздар және өнеркәсіптік полимерлер сияқты ірі молекулаларға немесе макромолекулалық кешендерге қолданылады. Егер үлгіні бағана арқылы тасымалдау үшін сулы ерітінді қолданылса, бұл әдіс гель сүзгісі хроматографиясы деп аталады, ал егер жылжымалы фаза ретінде органикалық еріткіш қолданылса, гель өткізгіш хроматографиясы деп аталады. Хроматографиялық бағана әдетте декстран, агароза немесе полиакриламид полимерлерінен жасалған ұсақ, кеуекті бөлшектермен толтырылады. Осы бөлшектердің тесік мөлшері макромолекулалардың өлшемдерін анықтау үшін пайдаланылады.

Қолданбалар

Өлшемін алып тастау хроматографиясының негізгі қолданылуы – ақуыздар және басқа да суда еритін полимерлерді фракциялау, ал гельдік өткізгіштік хроматографиясы органикалық еритін полимерлердің молекулалық салмағының таралуын талдау үшін қолданылады. Екі техниканың екеуін де гельдік электрофорезбен шатастыруға болмайды, онда электр өрісі молекулаларды олардың электр зарядтарына қарай гель арқылы "тартып" өткізеді. Ерітіндінің шұңқыр ішінде қалу уақыты шұңқырдың мөлшеріне байланысты. Ірі еритінділер кішірек көлемге қол жеткізеді, ал кіші еритінділер керісінше. Сондықтан, кіші еритінді ірі еритіндіге қарағанда шұңқыр ішінде ұзақ уақытқа қалады. Өлшемін алып тастау хроматографиясы табиғи органикалық материалды зерттеуде кеңінен қолданылса да, оның шектеулері бар. Осы шектеулердің бірі – стандартты молекулалық салмақ маркерінің болмауы, нәтижелерді салыстыруға арналған эталондық нүкте жоқ. Егер нақты молекулалық салмақ қажет болса, басқа әдістерді қолдану керек.

Артықшылықтар

Бұл әдістің артықшылықтарына үлкен молекулаларды кіші молекулалардан жақсы бөлу, элюаттың минималды көлемімен және сүзгілеу процесіне кедеріс келтірмей, әртүрлі ерітінділерді қолдану мүмкіндігі, сондай-ақ бөлінетін бөлшектердің биологиялық белсенділігін сақтау кіреді. Бұл техника, әдетте, молекулаларды олардың басқа да сипаттамалары бойынша – қышқылдық, негізділік, заряд, белгілі бір қосылыстарға деген туыстық қатынас бойынша бөліп, басқа әдістермен біріктіріледі. Өлшемді алып тастау хроматографиясында қысқа және анықталған бөлу уақыты мен тар жолақтар болады, бұл жақсы сезімталдыққа әкеледі. Сондай-ақ, сынама жоғалмайды, себебі еріген заттар тұрақты фазамен өзара әрекеттеспейді. Бұл тәжірибелік әдістің тағы бір артықшылығы – кейбір жағдайларда қосылыстың шамамен молекулалық салмағын анықтау мүмкіндігі. Қосылыстың пішіні мен мөлшері (элюент) оның гельмен (тұрақты фаза) қалай өзара әрекеттесетінін анықтайды. Шамамен молекулалық салмақты анықтау үшін қосылыстардың элюция көлемдері олардың сәйкес молекулалық салмақтарымен алынып, содан кейін “Kav” және “log(Mw)” графигі салынады, мұнда Kav тепе-тепес коэффициенті, ал Mw – молекулалық масса. Бұл график калибрлеу қисығы ретінде қолданылады, ол қажетті қосылыстың молекулалық салмағын шамамен анықтауға мүмкіндік береді. Ve компоненті орташа молекулалардың элюциясын көрсетеді, мысалы, бағана бөлшектеріне ішінара қол жеткізе алатын молекулалар. Сонымен қатар, Vt – бұл бөлшектер арасындағы және бөлшектер ішіндегі жалпы көлемнің қосындысы. Vo компоненті үлкен молекулалардың элюциясын көрсетеді, олар элюция процесінің басында шығады. Кемшіліктеріне мысал келтереді: хроматограмманың уақыт шкаласы қысқа болғандықтан, тек шектеулі ғана жолақтарды орналастыруға болады және, әдетте, жақсы ажырату үшін молекулалық массада 10% айырмашылық болуы керек. Кейіннен олар осы өнертабысы үшін Джон Скотт сыйлығын алды. Лате мен Рутвен матрица ретінде крахмал гельдерін қолданған, ал Джеркер Порат пен Пер Флодин кейін декстран гельдерін енгізді; өлшемді фракциялау қасиеттері бар басқа гельдерге агароза мен полиакриламид жатады. Бұл дамулар туралы қысқаша шолу жарияланды. Синтетикалық жоғары полимерлерді фракциялауға да талпыныстар жасалды; алайда, 1964 жылға дейін, Dow Chemical Company-дан Дж. К. Мур гельдік пермеациялық хроматография (GPC) бағаналарын дайындау жөніндегі жұмысын жариялағанға дейін, бұл салаға зерттеу қызметінің қарқынды өсуі басталған жоқ. Дұрыс калибрлеу кезінде GPC синтетикалық полимерлердің молярлық массасы және молярлық массаның таралуы туралы ақпарат бере алатыны бірден анықталды. Соңғы ақпаратды басқа әдістермен алу қиын болғандықтан, GPC тез арада кеңінен қолданыла бастады.

The advantages of this method include good separation of large molecules from the small molecules with a minimal volume of eluate, and that various solutions can be applied without interfering with the filtration process, all while preserving the biological activity of the particles to separate. The technique is generally combined with others that further separate molecules by other characteristics, such as acidity, basicity, charge, and affinity for certain compounds. With size exclusion chromatography, there are short and well defined separation times and narrow bands, which lead to good sensitivity. There is also no sample loss because solutes do not interact with the stationary phase. The other advantage to this experimental method is that in certain cases, it is feasible to determine the approximate molecular weight of a compound. The shape and size of the compound (eluent) determine how the compound interacts with the gel (stationary phase). To determine approximate molecular weight, the elution volumes of compounds with their corresponding molecular weights are obtained and then a plot of “Kav” vs “log(Mw)” is made, where and Mw is the molecular mass. This plot acts as a calibration curve, which is used to approximate the desired compound's molecular weight. The Ve component represents the volume at which the intermediate molecules elute such as molecules that have partial access to the beads of the column. In addition, Vt is the sum of the total volume between the beads and the volume within the beads. The Vo component represents the volume at which the larger molecules elute, which elute in the beginning. Disadvantages are, for example, that only a limited number of bands can be accommodated because the time scale of the chromatogram is short, and, in general, there must be a 10% difference in molecular mass to have a good resolution. They later received the John Scott Award for this invention. While Lathe and Ruthven used starch gels as the matrix, Jerker Porath and Per Flodin later introduced dextran gels; other gels with size fractionation properties include agarose and polyacrylamide. A short review of these developments has appeared. There were also attempts to fractionate synthetic high polymers; however, it was not until 1964, when J. C. Moore of the Dow Chemical Company published his work on the preparation of gel permeation chromatography (GPC) columns based on cross linked polystyrene with controlled pore size, that a rapid increase of research activity in this field began. It was recognized almost immediately that with proper calibration, GPC was capable to provide molar mass and molar mass distribution information for synthetic polymers. Because the latter information was difficult to obtain by other methods, GPC came rapidly into extensive use.

Сүзгілеуге әсер ететін факторлар

Нақты өмірдегі жағдайларда ерітіндідегі бөлшектердің белгілі бір мөлшері болмайды, сондықтан әдетте кедергі келтіретін бөлшек, тесік қасынан өтіп кетуі мүмкін. Сонымен қатар, стационарлық фаза бөлшектерінің мөлшері идеалды түрде анықталмайды; бөлшектердің де, тесіктердің де өлшемдері әртүрлі болуы мүмкін. Сондықтан элюция қисықтары Гаусс таралуына ұқсас келеді. Стационарлық фаза бөлшектермен қарама-қарсы әрекеттесіп, тұрақтандыру уақытына әсер етуі де мүмкін, бірақ бағана өндірушілер инертті стационарлық фазаларды қолдануға және осы мәселені азайтуға ерекше көңіл бөледі. Басқа хроматография түрлері сияқты, бағана ұзындығын арттыру ажыратымдылықты жақсартады, ал бағана диаметрін арттыру бағананың сыйымдылығын арттырады. Максималды ажыратымдылық үшін бағананы дұрыс жинақтау маңызды: тым тығыз жинақталған бағана бөлшектердегі тесіктерді құлатып, ажыратымдылықты төмендетуі мүмкін. Нашар жинақталған бағана кішкентай молекулаларға қолжетімді стационарлық фазаның бетін азайтып, олардың тесіктерде ұзақ уақыт тоқталуын қысқартуы мүмкін. Аффиниттік хроматографиядан айырмашылығы, бағананың үстіндегі еріткіш қабаты үлгі жүктелуден бұрын таралып, элюцияны кеңейтіп, ажыратымдылықты күрт төмендетуі мүмкін.

Талдау

Қарапайым қолмен басқарылатын бағандарда элюент тұрақты көлемдерде жиналады, бұл фракциялар деп аталады. Бөлшектердің мөлшері неғұрлым ұқсас болса, олардың бір фракцияда болуы және жеке анықталмауы ықтимал. Күрделірек бағандар элюентті үнемі бақылап, осы мәселені шешеді. [[Сурет:Chrom SephG 50.tif|thumb|right|300 px|Өсімдік үлгісінің биоанализдік үздіксіз элюциялық гель хроматографиясынан кейінгі мөлшерлік шығарылым хроматограммасы]]
Қозғалмалы фаза мен тұрақтандырғыш фаза арасындағы кез келген өзара әрекеттесу элюция уақытын кешіктіреді және аналит мөлшерінің кішірек болуын имитациялайды. Бұл әдіс қолданылғанда элюцияланатын молекулалардың жолақтары кеңейеді. Бұл қозғалмалы фаза молекулаларының тұрақтандырғыш фаза молекулалары арқылы өтуінен туындаған турбуленттілік нәтижесінде болуы мүмкін. Сонымен қатар, молекулалық жылулық диффузия және шыны қабырғалар мен элюент молекулалары арасындағы үйкеліс жолақтың кеңеюіне әсер етеді. Жолақтар кеңейгеннен бөлек, бір-бірімен де қабаттасады. Нәтижесінде элюент көбінесе айтарлықтай сұйытылады. Жолақтың кеңею мүмкіндігін азайту үшін бірнеше сақтық шараларын қолдануға болады. Мысалы, үлгіні бағанның жоғарғы жағына тар, жоғары концентрацияланған жолақ түрінде енгізуге болады. Элюенттің концентрациясы жоғары болса, процедура тиімдірек болады. Дегенмен, элюентті шоғырландыру әрқашан мүмкін емес, бұл тағы бір кемшілік ретінде қарастырылуы мүмкін. Бұл жағдайда "абсолютті" терминінің анықтамасы – молярлық массаны немесе гидродинамикалық мөлшерді (көбінесе гидродинамикалық диаметр, DH, нм бірліктерінде) алу үшін бағандағы тұру уақытын стандарттық эталондық үлгілер жиынтығымен калибрлеудің қажеті жоқ. Стандарттарға қатысты тұру уақытын өзгертетін электростатикалық немесе гидрофобтық беттік өзара әрекеттесулер сияқты идеалды емес баған өзара әрекеттесуі соңғы нәтижеге әсер етпейді. Сонымен қатар, аналит пен стандарттың конформациясы арасындағы айырмашылықтар абсолютті өлшеуге әсер етпейді; мысалы, MALS талдауында, табиғи түрде ретсіз ақуыздардың молярлық массасы дәл сипатталады, тіпті олар бірдей молярлық массасы бар шар тәрізді ақуыздарға қарағанда әлдеқайда ертерек элюцияланса да, сондай-ақ бірдей молярлық массасы бар сызықтық эталондық үлгілерге қарағанда кеш элюцияланатын тармақталған полимерлерге де қатысты. ASEC-тің тағы бір артықшылығы – молярлық масса және/немесе мөлшері элюцияланатын шыңның әр нүктесінде анықталады, бұл шыңның ішіндегі біртектілікті немесе полидисперстілікті көрсетеді. Мысалы, монодисперс ақуыздың SEC MALS талдауы шыңның барлығы бірдей молярлық массасы бар молекулалардан тұратындығын көрсетеді, бұл стандартты SEC талдауымен мүмкін емес. SLS арқылы молярлық массаны анықтау үшін жарық шашырауы өлшемдерін концентрация өлшемдерімен біріктіру қажет. Сондықтан SEC MALS әдетте жарық шашырауы детекторын және дифференциалдық рефрактометрді немесе УФ/ВИЗ сіңіру детекторын қамтиды. Сонымен қатар, MALS белгілі бір мөлшерлік шектен жоғары молекулалардың орташа квадрат радиусын (Rg) анықтайды, әдетте 10 нм. SEC MALS осылайша Rg-ге молярлық массаның қатынасы арқылы полимерлердің конформациясын талдауға мүмкіндік береді. Кіші молекулалар үшін гидродинамикалық радиусты анықтау және молекулалық конформацияны дәл осылай бағалау үшін DLS немесе көбінесе дифференциалдық вискозиметр қосылады. SEC DLS-де макромолекулалардың мөлшері мөлшерлік шығарылым бағанасынан DLS құралының ағын ұяшығына элюцияланғанда өлшенеді. Молекулалардың немесе бөлшектердің молекулалық салмағы емес, гидродинамикалық мөлшері өлшенеді. Ақуыздар үшін Mark Houwink типіндегі есептеу гидродинамикалық мөлшерден молекулалық салмақты бағалау үшін қолданылуы мүмкін. SEC-пен біріктірілген DLS-тің басты артықшылығы – DLS шешілу қабілетін жақсарту. Баталық DLS жылдам және қарапайым және орташа мөлшерді тікелей өлшеуге мүмкіндік береді, бірақ DLS негізгі шешілуі диаметр бойынша 3:1 арақатынаста. SEC-ті қолдану арқылы ақуыздар мен ақуыз олигомерлері бөлінеді, бұл олигомерлік шешілуге мүмкіндік береді. Агрегациялық зерттеулерді ASEC-ті қолдану арқылы да жүргізуге болады. Агрегаттық концентрацияны жарық шашырауымен есептеуге болмаса да (SEC MALS-те молярлық массаны өлшеу үшін қолданылатын онлайн концентрация детекторы агрегаттық концентрацияны да анықтайды), агрегаттың мөлшерін өлшеуге болады, бұл тек SEC бағаналарынан элюцияланатын ең үлкен мөлшермен шектеледі. DLS анықтауы бар ASEC-тің шектеулері ағын жылдамдығын, концентрацияны және дәлдікті қамтиды. Корреляциялық функция дұрыс құрылуы үшін 3-7 секунд қажет болғандықтан, шыңның бойымен шектеулі сандағы деректер нүктелерін жинауға болады. SLS анықтауы бар ASEC ағын жылдамдығымен шектеледі және өлшеу уақыты негізінен жедел, ал концентрация диапазоны DLS-ке қарағанда бірнеше есе үлкен. Дегенмен, SEC MALS арқылы молярлық массаны талдау үшін дәл концентрация өлшемдері қажет. Күрделі абсолютті талдау үшін MALS және DLS детекторлары көбінесе бір құралда біріктіріледі, SEC арқылы бөлуден кейін.

In simple manual columns, the eluent is collected in constant volumes, known as fractions. The more similar the particles are in size the more likely they are in the same fraction and not detected separately. More advanced columns overcome this problem by constantly monitoring the eluent. [[Image:Chrom SephG 50. tif|thumb|right|300 px|Size exclusion chromatogram after bioanalytical continuous elution gel chromatography of a plant sample
Another drawback is the possibility of interaction between the stationary phase and the analyte. Any interaction leads to a later elution time and thus mimics a smaller analyte size. When performing this method, the bands of the eluting molecules may be broadened. This can occur by turbulence caused by the flow of the mobile phase molecules passing through the molecules of the stationary phase. In addition, molecular thermal diffusion and friction between the molecules of the glass walls and the molecules of the eluent contribute to the broadening of the bands. Besides broadening, the bands also overlap with each other. As a result, the eluent usually gets considerably diluted. A few precautions can be taken to prevent the likelihood of the bands broadening. For instance, one can apply the sample in a narrow, highly concentrated band on the top of the column. The more concentrated the eluent is, the more efficient the procedure would be. However, it is not always possible to concentrate the eluent, which can be considered as one more disadvantage. The definition of “absolute” in this case is that calibration of retention time on the column with a set of reference standards is not required to obtain molar mass or the hydrodynamic size, often referred to as hydrodynamic diameter (DH in units of nm). Non ideal column interactions, such as electrostatic or hydrophobic surface interactions that modulate retention time relative to standards, do not impact the final result. Likewise, differences between conformation of the analyte and the standard have no effect on an absolute measurement; for example, with MALS analysis, the molar mass of inherently disordered proteins are characterized accurately even though they elute at much earlier times than globular proteins with the same molar mass, and the same is true of branched polymers which elute late compared to linear reference standards with the same molar mass. Another benefit of ASEC is that the molar mass and/or size is determined at each point in an eluting peak, and therefore indicates homogeneity or polydispersity within the peak. For example, SEC MALS analysis of a monodisperse protein will show that the entire peak consists of molecules with the same molar mass, something that is not possible with standard SEC analysis. Determination of molar mass with SLS requires combining the light scattering measurements with concentration measurements. Therefore SEC MALS typically includes the light scattering detector and either a differential refractometer or UV/Vis absorbance detector. In addition, MALS determines the rms radius Rg of molecules above a certain size limit, typically 10 nm. SEC MALS can therefore analyze the conformation of polymers via the relationship of molar mass to Rg. For smaller molecules, either DLS or, more commonly, a differential viscometer is added to determine hydrodynamic radius and evaluate molecular conformation in the same manner. In SEC DLS, the sizes of the macromolecules are measured as they elute into the flow cell of the DLS instrument from the size exclusion column set. The hydrodynamic size of the molecules or particles are measured and not their molecular weights. For proteins a Mark Houwink type of calculation can be used to estimate the molecular weight from the hydrodynamic size. A major advantage of DLS coupled with SEC is the ability to obtain enhanced DLS resolution. Batch DLS is quick and simple and provides a direct measure of the average size, but the baseline resolution of DLS is a ratio of 3:1 in diameter. Using SEC, the proteins and protein oligomers are separated, allowing oligomeric resolution. Aggregation studies can also be done using ASEC. Though the aggregate concentration may not be calculated with light scattering (an online concentration detector such as that used in SEC MALS for molar mass measurement also determines aggregate concentration), the size of the aggregate can be measured, only limited by the maximum size eluting from the SEC columns. Limitations of ASEC with DLS detection include flow rate, concentration, and precision. Because a correlation function requires anywhere from 3–7 seconds to properly build, a limited number of data points can be collected across the peak. ASEC with SLS detection is not limited by flow rate and measurement time is essentially instantaneous, and the range of concentration is several orders of magnitude larger than for DLS. However, molar mass analysis with SEC MALS does require accurate concentration measurements. MALS and DLS detectors are often combined in a single instrument for more comprehensive absolute analysis following separation by SEC.