Хроматография исключения размера: разделение молекул по величине и молекулярному весу.

Введение

Хроматографический метод, в котором растворенные молекулы разделяются по размеру и молекулярному весу.

Хроматография исключения размера, также известная как молекулярно-ситовая хроматография, – это хроматографический метод, в котором молекулы в растворе разделяются по размеру, а в некоторых случаях и по молекулярному весу. Обычно применяется для крупных молекул или макромолекулярных комплексов, таких как белки и промышленные полимеры. Как правило, когда водный раствор используется для переноса образца через колонку, метод называется гель-фильтрационной хроматографией, в отличие от гель-проницаемой хроматографии, которая используется при применении органического растворителя в качестве подвижной фазы. Хроматографическая колонка заполнена мелкими пористыми шариками, обычно состоящими из полимеров декстрана, агарозы или полиакриламида. Размеры пор этих шариков используются для определения размеров макромолекул.

Приложения

Основным применением гель-фильтрационной хроматографии (хроматографии исключения размера) является фракционирование белков и других водорастворимых полимеров, в то время как гель-проникающая хроматография используется для анализа распределения молекулярных масс органически растворимых полимеров. Ни одну из этих техник не следует путать с гелевым электрофорезом, где электрическое поле используется для перемещения молекул через гель в зависимости от их электрического заряда. Время пребывания растворенного вещества в поре зависит от размера этой поры. Более крупные растворенные вещества имеют доступ к меньшему объему, и наоборот. Следовательно, более мелкое растворенное вещество будет оставаться в поре дольше, чем более крупное. Несмотря на широкое использование гель-фильтрационной хроматографии для изучения природных органических материалов, существуют ограничения. Одно из них заключается в отсутствии стандартных молекулярно-массовых маркеров, что затрудняет сопоставление полученных результатов. Если требуется определение точной молекулярной массы, следует использовать другие методы.

Преимущества

Преимущества этого метода включают хорошее разделение крупных и малых молекул с минимальным объемом элюата, а также возможность применения различных растворов без влияния на процесс фильтрации, при этом сохраняя биологическую активность разделяемых частиц. Эта методика обычно комбинируется с другими, которые обеспечивают дальнейшее разделение молекул по другим характеристикам, таким как кислотность, основность, заряд и аффинность к определенным соединениям. При гель-фильтрационной хроматографии наблюдаются короткие и четко определенные времена разделения и узкие пики, что обеспечивает высокую чувствительность. Также отсутствует потеря образца, поскольку растворенные вещества не взаимодействуют со стационарной фазой. Другим преимуществом этого экспериментального метода является возможность определения приблизительной молекулярной массы соединения в определенных случаях. Форма и размер соединения (элюента) определяют характер его взаимодействия с гелем (стационарной фазой). Для определения приблизительной молекулярной массы получают объемы элюирования соединений с известными молекулярными массами, а затем строят график зависимости Kav от log(Mw), где Kav – коэффициент удерживания, а Mw – молекулярная масса. Этот график служит калибровочной кривой, используемой для приблизительной оценки молекулярной массы целевого соединения. Компонент Ve представляет собой объем, при котором элюируют промежуточные молекулы, например, молекулы с частичным доступом к частицам сорбента в колонке. Кроме того, Vt – это сумма общего объема между частицами сорбента и объема внутри частиц. Компонент Vo представляет собой объем, при котором элюируют более крупные молекулы, элюирующиеся в начале процесса. К недостаткам можно отнести, например, ограниченное количество разделяемых пиков из-за короткой шкалы времени хроматограммы и необходимость разницы в молекулярной массе не менее 10% для достижения хорошего разрешения. Позже они были удостоены премии Джона Скотта за это изобретение. В то время как Латх и Рутвен использовали крахмальные гели в качестве матрицы, Джеркер Порат и Пер Флодин впоследствии ввели декстрановые гели; другие гели, обладающие свойствами фракционирования по размеру, включают агарозу и полиакриламид. Имеются краткие обзоры этих разработок. Также предпринимались попытки фракционировать синтетические высокополимеры; однако значительный прогресс в этой области был достигнут только в 1964 году, когда Дж. С. Мур из компании Dow Chemical Company опубликовал свою работу по приготовлению колонн для гель-проницаемой хроматографии (GPC) на основе сшитого полистирола с контролируемым размером пор. Практически сразу стало очевидно, что при правильной калибровке GPC позволяет получать информацию о молярной массе и распределении молярной массы синтетических полимеров. Поскольку получение такой информации другими методами было затруднено, GPC быстро получил широкое распространение.

The advantages of this method include good separation of large molecules from the small molecules with a minimal volume of eluate, and that various solutions can be applied without interfering with the filtration process, all while preserving the biological activity of the particles to separate. The technique is generally combined with others that further separate molecules by other characteristics, such as acidity, basicity, charge, and affinity for certain compounds. With size exclusion chromatography, there are short and well defined separation times and narrow bands, which lead to good sensitivity. There is also no sample loss because solutes do not interact with the stationary phase. The other advantage to this experimental method is that in certain cases, it is feasible to determine the approximate molecular weight of a compound. The shape and size of the compound (eluent) determine how the compound interacts with the gel (stationary phase). To determine approximate molecular weight, the elution volumes of compounds with their corresponding molecular weights are obtained and then a plot of “Kav” vs “log(Mw)” is made, where and Mw is the molecular mass. This plot acts as a calibration curve, which is used to approximate the desired compound's molecular weight. The Ve component represents the volume at which the intermediate molecules elute such as molecules that have partial access to the beads of the column. In addition, Vt is the sum of the total volume between the beads and the volume within the beads. The Vo component represents the volume at which the larger molecules elute, which elute in the beginning. Disadvantages are, for example, that only a limited number of bands can be accommodated because the time scale of the chromatogram is short, and, in general, there must be a 10% difference in molecular mass to have a good resolution. They later received the John Scott Award for this invention. While Lathe and Ruthven used starch gels as the matrix, Jerker Porath and Per Flodin later introduced dextran gels; other gels with size fractionation properties include agarose and polyacrylamide. A short review of these developments has appeared. There were also attempts to fractionate synthetic high polymers; however, it was not until 1964, when J. C. Moore of the Dow Chemical Company published his work on the preparation of gel permeation chromatography (GPC) columns based on cross linked polystyrene with controlled pore size, that a rapid increase of research activity in this field began. It was recognized almost immediately that with proper calibration, GPC was capable to provide molar mass and molar mass distribution information for synthetic polymers. Because the latter information was difficult to obtain by other methods, GPC came rapidly into extensive use.

Факторы, влияющие на фильтрацию

В реальных ситуациях частицы в растворе не имеют фиксированного размера, что повышает вероятность того, что частица, которая в противном случае была бы задержана порой, пройдёт мимо неё. Кроме того, частицы стационарной фазы не имеют чётко определённых размеров; как частицы, так и поры могут варьироваться по размеру. Поэтому элюирующие кривые напоминают гауссовы распределения. Стационарная фаза также может нежелательно взаимодействовать с частицами и влиять на время удерживания, хотя производители колонок тщательно выбирают инертные стационарные фазы, чтобы минимизировать эту проблему. Как и в других видах хроматографии, увеличение длины колонки повышает разрешение, а увеличение диаметра колонки – её ёмкость. Правильная упаковка колонки важна для достижения максимального разрешения: чрезмерно плотная упаковка может привести к схлопыванию пор в сорбенте, что снижает разрешение. Недостаточно плотная упаковка может уменьшить относительную площадь поверхности стационарной фазы, доступную для более мелких молекул, в результате чего они будут меньше времени задерживаться в порах. В отличие от методов аффинной хроматографии, наличие слоя растворителя в верхней части колонки может значительно снизить разрешение, поскольку образец диффундирует до загрузки, что приводит к уширению пиков элюирования.

Анализ

В простых ручных колонках элюент собирается в постоянных объемах, известных как фракции. Чем более схожи частицы по размеру, тем выше вероятность того, что они окажутся в одной и той же фракции и не будут обнаружены раздельно. Более продвинутые колонки решают эту проблему, постоянно контролируя элюент. [[Изображение:Chrom SephG 50.tif|thumb|right|300 px|Хроматограмма исключения размера после биоаналитической непрерывной гель-хроматографии образца растения]] Другим недостатком является возможность взаимодействия между стационарной фазой и аналитом. Любое взаимодействие приводит к увеличению времени элюирования и, следовательно, имитирует меньший размер аналита. При использовании этого метода полосы элюирующихся молекул могут расширяться. Это может быть вызвано турбулентностью, возникающей из-за потока молекул подвижной фазы, проходящих через молекулы стационарной фазы. Кроме того, молекулярная тепловая диффузия и трение между молекулами стенок колонки и молекулами элюента способствуют расширению полос. Помимо расширения, полосы также могут перекрываться. В результате элюент обычно значительно разбавляется. Можно предпринять несколько мер предосторожности для снижения вероятности расширения полос. Например, образец можно нанести в узкую, высококонцентрированную полосу на верхнюю часть колонки. Чем выше концентрация элюента, тем эффективнее будет процедура. Однако не всегда возможно сконцентрировать элюент, что также можно рассматривать как недостаток. Определение "абсолютного" в данном случае заключается в том, что для получения молярной массы или гидродинамического размера, часто называемого гидродинамическим диаметром (DH в единицах нм), не требуется калибровка времени удерживания на колонке с использованием набора стандартных образцов. Неидеальные взаимодействия с колонкой, такие как электростатические или гидрофобные поверхностные взаимодействия, которые модулируют время удерживания относительно стандартов, не влияют на конечный результат. Аналогично, различия в конформации аналита и стандарта не оказывают влияния на абсолютное измерение; например, при анализе MALS молярная масса белков, по своей природе неупорядоченных, характеризуется точно, даже если они элюируют намного раньше, чем глобулярные белки с той же молярной массой, и то же самое справедливо для разветвленных полимеров, которые элюируют позже, чем линейные стандартные образцы с той же молярной массой. Еще одним преимуществом ASEC является то, что молярная масса и/или размер определяются в каждой точке элюирующего пика, что указывает на однородность или полидисперсность внутри пика. Например, анализ SEC MALS монодисперсного белка покажет, что весь пик состоит из молекул с одинаковой молярной массой, что невозможно при стандартном анализе SEC. Определение молярной массы с помощью SLS требует объединения измерений рассеяния света с измерениями концентрации. Поэтому SEC MALS обычно включает в себя детектор рассеяния света и дифференциальный рефрактометр или УФ/Vis спектрофотометр. Кроме того, MALS определяет среднеквадратичный радиус Rg молекул свыше определенного предела размера, обычно 10 нм. SEC MALS может анализировать конформацию полимеров на основе соотношения молярной массы к Rg. Для меньших молекул добавляется DLS или, чаще, дифференциальный вискозиметр для определения гидродинамического радиуса и оценки молекулярной конформации аналогичным образом. В SEC DLS размеры макромолекул измеряются по мере их элюирования в проточную ячейку прибора DLS из колонки для исключения размера. Измеряется гидродинамический размер молекул или частиц, а не их молекулярный вес. Для белков можно использовать расчет типа Марка-Хоувинка для оценки молекулярного веса на основе гидродинамического размера. Основным преимуществом DLS в сочетании с SEC является возможность получения повышенного разрешения DLS. DLS быстр и прост и обеспечивает прямое измерение среднего размера, но базовое разрешение DLS составляет соотношение 3:1 по диаметру. Использование SEC позволяет разделить белки и белковые олигомеры, что обеспечивает разрешение олигомерных процессов. Исследования агрегации также могут быть проведены с использованием ASEC. Хотя концентрация агрегатов не может быть рассчитана с помощью рассеяния света (онлайн-детектор концентрации, такой как используемый в SEC MALS для измерения молярной массы, также определяет концентрацию агрегатов), размер агрегатов может быть измерен, что ограничено только максимальным размером, элюируемым из колонок SEC. Ограничения ASEC с DLS-детектированием включают скорость потока, концентрацию и точность. Поскольку для правильного построения корреляционной функции требуется от 3 до 7 секунд, количество данных, собранных по пику, ограничено. ASEC с SLS-детектированием не ограничивается скоростью потока, а время измерения практически мгновенно, а диапазон концентраций на несколько порядков больше, чем для DLS. Однако анализ молярной массы с помощью SEC MALS требует точных измерений концентрации. MALS и DLS-детекторы часто объединяются в одном приборе для более комплексного абсолютного анализа после разделения с помощью SEC.

In simple manual columns, the eluent is collected in constant volumes, known as fractions. The more similar the particles are in size the more likely they are in the same fraction and not detected separately. More advanced columns overcome this problem by constantly monitoring the eluent. [[Image:Chrom SephG 50. tif|thumb|right|300 px|Size exclusion chromatogram after bioanalytical continuous elution gel chromatography of a plant sample
Another drawback is the possibility of interaction between the stationary phase and the analyte. Any interaction leads to a later elution time and thus mimics a smaller analyte size. When performing this method, the bands of the eluting molecules may be broadened. This can occur by turbulence caused by the flow of the mobile phase molecules passing through the molecules of the stationary phase. In addition, molecular thermal diffusion and friction between the molecules of the glass walls and the molecules of the eluent contribute to the broadening of the bands. Besides broadening, the bands also overlap with each other. As a result, the eluent usually gets considerably diluted. A few precautions can be taken to prevent the likelihood of the bands broadening. For instance, one can apply the sample in a narrow, highly concentrated band on the top of the column. The more concentrated the eluent is, the more efficient the procedure would be. However, it is not always possible to concentrate the eluent, which can be considered as one more disadvantage. The definition of “absolute” in this case is that calibration of retention time on the column with a set of reference standards is not required to obtain molar mass or the hydrodynamic size, often referred to as hydrodynamic diameter (DH in units of nm). Non ideal column interactions, such as electrostatic or hydrophobic surface interactions that modulate retention time relative to standards, do not impact the final result. Likewise, differences between conformation of the analyte and the standard have no effect on an absolute measurement; for example, with MALS analysis, the molar mass of inherently disordered proteins are characterized accurately even though they elute at much earlier times than globular proteins with the same molar mass, and the same is true of branched polymers which elute late compared to linear reference standards with the same molar mass. Another benefit of ASEC is that the molar mass and/or size is determined at each point in an eluting peak, and therefore indicates homogeneity or polydispersity within the peak. For example, SEC MALS analysis of a monodisperse protein will show that the entire peak consists of molecules with the same molar mass, something that is not possible with standard SEC analysis. Determination of molar mass with SLS requires combining the light scattering measurements with concentration measurements. Therefore SEC MALS typically includes the light scattering detector and either a differential refractometer or UV/Vis absorbance detector. In addition, MALS determines the rms radius Rg of molecules above a certain size limit, typically 10 nm. SEC MALS can therefore analyze the conformation of polymers via the relationship of molar mass to Rg. For smaller molecules, either DLS or, more commonly, a differential viscometer is added to determine hydrodynamic radius and evaluate molecular conformation in the same manner. In SEC DLS, the sizes of the macromolecules are measured as they elute into the flow cell of the DLS instrument from the size exclusion column set. The hydrodynamic size of the molecules or particles are measured and not their molecular weights. For proteins a Mark Houwink type of calculation can be used to estimate the molecular weight from the hydrodynamic size. A major advantage of DLS coupled with SEC is the ability to obtain enhanced DLS resolution. Batch DLS is quick and simple and provides a direct measure of the average size, but the baseline resolution of DLS is a ratio of 3:1 in diameter. Using SEC, the proteins and protein oligomers are separated, allowing oligomeric resolution. Aggregation studies can also be done using ASEC. Though the aggregate concentration may not be calculated with light scattering (an online concentration detector such as that used in SEC MALS for molar mass measurement also determines aggregate concentration), the size of the aggregate can be measured, only limited by the maximum size eluting from the SEC columns. Limitations of ASEC with DLS detection include flow rate, concentration, and precision. Because a correlation function requires anywhere from 3–7 seconds to properly build, a limited number of data points can be collected across the peak. ASEC with SLS detection is not limited by flow rate and measurement time is essentially instantaneous, and the range of concentration is several orders of magnitude larger than for DLS. However, molar mass analysis with SEC MALS does require accurate concentration measurements. MALS and DLS detectors are often combined in a single instrument for more comprehensive absolute analysis following separation by SEC.