Флуоресценттік in situ гибридтеу: генетикалық тесттеу әдісі

Кіріспе

Генетикалық сынақ техникасы

Флуоресценттік in situ гибридтеу (FISH) – жоғары дәрежедегі реттілік сәйкестігі бар нуклеин қышқылының нақты белгілі бөліктеріне ғана байланысатын флуоресценттік зондтарды қолданатын молекулалық цитогенетикалық техника. Ол 1980-ші жылдардың басында биомедициналық зерттеушілер тарапынан хромосомалардағы нақты ДНК реттіліктерінің болуын немесе болмауын анықтау және оларды локализациялау мақсатымен әзірленген. Флуоресценттік микроскопия флуоресценттік зондтың хромосомаларға қай жерде байланысқандығын анықтау үшін қолданылуы мүмкін. FISH жиі генетикалық кеңес беру, медицина және түрлерді анықтау үшін ДНК-дағы нақты белгілерді табуға пайдаланылады. FISH сондай-ақ жасушалардағы, қан айналымындағы ісік жасушаларындағы және тіндердегі нақты РНК нысандарын (мРНК, ұзын емес кодтамалы РНК және миРНК) анықтау және локализациялау үшін де қолданылуы мүмкін. Осы контексте ол жасушалар мен тіндердегі ген экспрессиясының кеңістіктік-уақыттық үлгілерін анықтауға көмектеседі.

Зондтар РНК және ДНҚ

Биологияда зонд – ДНК немесе РНК-ның бір тізбегі, ол ізделіп отырған нуклеотидтік тізбекке толыққанды сәйкес келеді. РНК зондтары кез келген генге немесе ген ішіндегі кез келген тізбекке арналған, тіндер мен жасушаларда мРНК, ұзақ емес РНК (lncRNA) және микроРНК (miRNA) визуализациялау үшін қолданылады. FISH әдісі жасушалық көбею циклын, әсіресе ядролардың интерфазасын зерттеу арқылы кез келген хромосомалық аномалияларды анықтау үшін пайдаланылады. FISH мұрағатталған көптеген жағдайларды талдауды жеңілдетеді, себебі ұқсас хромосомаларды тартатын жасанды хромосомалық негізде зонд жасау арқылы нақты хромосоманы анықтау оңайырақ болады. Процесс 3 негізгі кезеңнен тұрады: тінді дайындау (гибридтеуден бұрын), гибридтеу және жуу (гибридтеуден кейін). Тінді дайындау РНК FISH жүргізу үшін қажетті тіндік бөліктерді жинаудан басталады. Алдымен жасушалар, қан ағынындағы ісік жасушалары (CTC), формалинмен бекітілген парафинге сіңген (FFPE) немесе мұздатылған тіндік бөліктер бекітіледі. Көбінесе қолданылатын бекіткіштер – 4% формальдегид немесе параформальдегид (PFA) фосфат буферленген физиологиялық тұз ерітіндісінде (PBS). Бекітуден кейін үлгілер гибридтеу реагенттерінің енуіне мүмкіндік беру үшін өткізгіштікке келтіріледі. Тіндік өткізгіштікті арттыру үшін 0,1% концентрациядағы Tween 20 немесе Triton X 100 сияқты жуғыш заттар қолданылады. Гибридтеу процесінің сәтті болуы үшін температура, pH, тұз концентрациясы және гибридтеу реакциясының уақыты сияқты барлық оңтайлы жағдайлардың сақталуы маңызды. Барлық қажетті жағдайлар тексерілгеннен кейін, гибридтеу кезеңдерін бастауға болады, біріншіден 20 олигонуклеотидтік жұптан тұратын, мақсатты РНК-ға гибридтелетін мақсатты арнайы зонд қосылады. Жеке, бірақ үйлесімді сигнал күшейткіш жүйелері мультиплекстік талдауға (бір талдауға екі мақсатқа дейін) мүмкіндік береді. Сигнал күшейтілуі тізбектелген гибридтеу кезеңдері арқылы жүзеге асырылады. Гибридтеу кезеңдерінен кейін жуу кезеңдері орындалады. Бұл кезеңдердің мақсаты – нақты емес гибридтеулерді жою және үлгілерден байланбаған зонд молекулаларын кетіру арқылы кез келген фонылық сигналды азайту. Бұл кезеңде тіндер мен жасушалардағы автофлуоресценцияны азайту үшін этанолмен жуу әдістері қолданылады. Талдаудың соңында тіндік үлгілер флуоресценттік микроскоппен, мысалы конфокалды флуоресценттік микроскоппен және Keyence микроскопымен қаралады. Немесе smFISH – бұл тіндік үлгінің жұқа қабатында мРНК және басқа да ұзын РНК молекулаларын анықтау және сандық өлшеу әдісі. Мақсаттарды бірнеше қысқа, жеке-жеке флуоресцентті белгіленген олигонуклеотидтік зондтарды қолдану арқылы сенімді түрде бейнелеуге болады. 48 флуоресцентті белгісі бар олиголардың мРНК молекуласына байланысуы әрбір мақсатты мРНК-ны кең өрісті флуоресценттік микроскопиялық кескінде дәл анықтау және орналастыру үшін жеткілікті флуоресценцияны қамтамасыз етеді. Көрсетілген тізбекке байланыспаған зондтар фоннан ажыратуға жеткілікті жергілікті флуоресценцияға қол жеткізе алмайды. Бір молекулалық РНК FISH талдауын симплекс немесе мультиплекс режимінде жүргізуге болады, және ол сандық ПТР-ге қосымша эксперимент ретінде немесе флуоресцентті антидене талдауымен бір мезгілде жүргізілуі мүмкін. Бұл технологияның қатерлі ісіктерді диагностикалау, нейробиология, гендік экспрессияны талдау және серіктес диагностикасында қолданылуы мүмкін.

In biology, a probe is a single strand of DNA or RNA that is complementary to a nucleotide sequence of interest. RNA probes can be designed for any gene or any sequence within a gene for visualization of mRNA, lncRNA and miRNA in tissues and cells. FISH is used by examining the cellular reproduction cycle, specifically interphase of the nuclei for any chromosomal abnormalities. FISH allows the analysis of a large series of archival cases much easier to identify the pinpointed chromosome by creating a probe with an artificial chromosomal foundation that will attract similar chromosomes. The process is done in 3 main procedures: tissue preparation (pre hybridization), hybridization, and washing (post hybridization). The tissue preparation starts by collecting the appropriate tissue sections to perform RNA FISH. First, cells, circulating tumor cells (CTCs), formalin fixed paraffin embedded (FFPE), or frozen tissue sections are fixed. Some commonly used fixatives are 4% formaldehyde or paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS). After fixation, samples are permeabilized to allow the penetration of hybridization reagents. The use of detergents at a 0.1% concentration is commonly used to enhance the tissue permeability such as Tween 20 or Triton X 100. It is critical for the hybridization process to have all optimal conditions to have a successful in situ result, including temperature, pH, salt concentration, and time of the hybridization reaction. After checking all the necessary conditions, hybridization steps can be started by first adding a target specific probe, composed of 20 oligonucleotide pairs, hybridizes to the target RNA(s). Separate but compatible signal amplification systems enable the multiplex assay (up to two targets per assay). Signal amplification is achieved via series of sequential hybridization steps. After the hybridization steps, washing steps are performed. These steps aim to remove nonspecific hybrids and get rid of unbound probe molecules from the samples to reduce any background signaling. The use of ethanol washes are typically used at this stage to reduce autofluorescence in tissues or cells. At the end of the assay the tissue samples are visualized under a fluorescence microscope such as the confocal fluorescence microscope and the Keyence microscope. or smFISH, is a method of detecting and quantifying mRNA and other long RNA molecules in a thin layer of tissue sample. Targets can be reliably imaged through the application of multiple short singly labeled oligonucleotide probes. The binding of up to 48 fluorescent labeled oligos to a single molecule of mRNA provides sufficient fluorescence to accurately detect and localize each target mRNA in a wide field fluorescent microscopy image. Probes not binding to the intended sequence do not achieve sufficient localized fluorescence to be distinguished from background. Single molecule RNA FISH assays can be performed in simplex or multiplex, and can be used as a follow up experiment to quantitative PCR, or imaged simultaneously with a fluorescent antibody assay. The technology has potential applications in cancer diagnosis, neuroscience, gene expression analysis, and companion diagnostics.

Балық талшығы

Интерфазалық немесе метафазалық препараттарға баламалы техника ретінде, талшықты FISH-те интерфазалық хромосомалар слайдқа сондай етіп бекітіледі, олар әдеттегі FISH сияқты тығыз оралмай, немесе интерфазалық FISH сияқты хромосомалық аумақ құрылымын қабылдамай, түзу сызық бойында созылады. Бұл слайдтың ұзындығы бойынша механикалық күш түсіру арқылы жүзеге асырылады, ол слайдқа бекітіліп, кейін лизделген жасушаларға немесе тазартылған ДНҚ ерітіндісіне қолданылады. Бұл мақсатта хромосоманы тарату әдісі жиі қолданылады. Хромосомалардың созылған конформациясы бірнеше килобазаға дейін едәуір жоғары ажыратымдылыққа мүмкіндік береді. Талшықты FISH үлгілерін дайындау, түсінік тұрғысынан қарапайым болғанымен, өте шеберлік қажетті өнер болып табылады және бұл техниканы тек мамандандырылған зертханалар ғана тұрақты түрде қолданады.

Q-FISH

Q FISH – бұл FISH әдісін PNA және компьютерлік бағдарламалық құралдармен үйлестіріп, флуоресценция интенсивтілігін сандық өлшеуге мүмкіндік береді. Бұл техника теломера ұзындығын зерттеуде кеңінен қолданылады.

Ағып жүретін балық

Flow FISH ағыс цитометриясын қолданып, әр жасушаның флуоресценциялық өлшемдері арқылы FISH-ті автоматты түрде жүзеге асырады.

MA-FISH

Микрофлюидтік көмекпен FISH (MA FISH) ДНК гибридтеу тиімділігін арттыру үшін микрофлюидтік ағынды қолданады, қымбат FISH зондтарының қолданылуын азайтады және гибридтеу уақытын қысқартады. MA FISH сүт безі қатерлі ісігінің тіндерінде HER2 генін анықтауға қолданылады.

Теңіз балығы

Микроавторадиографиялық FISH – бұл радиоактивті белгіленген субстраттарды дәстүрлі FISH әдісімен үйлестіріп, филогенетикалық топтарды және метаболизмінің белсенділігін бір уақытта анықтау техникасы.

Гибридті синтез-ФИШ

Гибридтік синтезделген FISH (HF FISH) флюорофорлардың бастапқы қосымша қозу/шығарылым комбинациясын динамикалық оптикалық тарату (DOT) деп аталатын белгілеу процесі арқылы қосымша спектрлерді жасау үшін қолданады. Үш негізгі флюорофор DOT арқылы комбинаторлық белгілеудің нәтижесінде жалпы 7 оңай анықталатын шығарылым спектрін тудыра алады. Гибридтік синтезделген FISH клиникалық онкологиялық панельдерде қолданылатын жоғары мультиплексті FISH қолданбаларын іске асырады. Бұл технология дәстүрлі флуоресцентті микроскоптармен оңай анықталатын тиімді зондтар арқылы жылдам бағалау мүмкіндігін ұсынады.

МЕРФИШ

Мултиплексті қателікке төзімді флуоресценциялық in situ гибридтеу – бұл smFISH-тің жоғары мультиплексті түрі. Ол комбинаторлық белгілеуді, одан кейін бейнелеуді және қатеге төзімді кодтауды пайдаланады, арқасында көптеген РНК молекулаларын анықтап, жасуша ішіндегі олардың кеңістіктік орналасуын анықтауға болады. Көптеген РНК молекулаларын анықтау гендік реттеу желілерін түсінуге, белгісіз гендердің функцияларын болжауға және олармен байланысты ақуыздарға сәйкес РНК молекулаларының таралу үлгілерін анықтауға мүмкіндік береді.

ҚОЛДЫРЫҚ

Starfish – ғалымдар консорциумының 2019 жылы FISH-тің тоғыз әртүрлі түрінен алынған деректерді талдау үшін әзірлеген бағдарламалық құралдар жиынтығы. Барлық түрлер бірдей деректер жиынтығын – жасушадағы x және y координаттарына бейнеленген гендік экспрессия мәндерін шығарады. Бұл бағдарлама биоинформатиктер ғана емес, барлық ғалымдар үшін жасалған, ол суреттерді оқиды, қырысуды (шуды) жояды және РНК молекулаларын анықтайды. Осы тәсіл FISH деректер жиынтығын талдаудың стандартты схемасын, бір жасушалық транскриптомикалық талдау сияқты, анықтауға бағытталған.

Медициналық қолдану

Көбінесе даму мүкіндіктері шектеулі балалары бар ата-аналар, тағы бір бала көруге шешім қабылдамас бұрын, балаларының жағдайы туралы көбірек білуге тырысады. Осындай алаңдаушылықтарды ата-аналар мен баланың ДНК-сын талдау арқылы шешуге болады. Егер баланың дамуындағы кемшіліктердің себебі белгісіз болса, FISH және цитогенетикалық әдістерді қолдану арқылы оның себебін анықтау мүмкін. FISH арқылы диагностикаланатын аурулардың мысалдары: Прадер-Вилли синдромы, Ангельман синдромы, 22q13 делеция синдромы, созылмалы миелогенді лейкемия, сүзіліс лимфобластық лейкемия, «Мысық жылауы» синдромы, велокардиофациалды синдром және Даун синдромы. Соматикалық немесе мейотикалық кариотипінде аномалиялары бар, сондай-ақ олигозооспермиясы бар еркектерге сперматозоидтарда FISH зерттеуі тағайындалады, себебі олигозооспермиясы бар еркектердің шамамен 50%-ында сперматозоид хромосомаларында аномалиялар жиі кездеседі. Олигозооспермиямен қауіпті адамдарды анықтау үшін 21, X және Y хромосомаларын талдау жеткілікті.

Түрді анықтау

FISH медициналық микробиология саласында патогендерді анықтау үшін диагностикалық әдіс ретінде жан-жақты зерттелді. Оның пайдалы және қолданылатын әдіс екені дәлелденгенімен, диагностикалық зертханаларда кеңінен қолданылмайды. Диагностикаға жетудің жылдамдығы (2 сағаттан кем) биохимиялық дифференциацияға қарағанда маңызды артықшылық болды, бірақ бұл артықшылық MALDI TOF MS жүйесімен күйретілді, ол биохимиялық дифференциация әдістерімен салыстырғанда патогендердің кең ауқымын анықтауға мүмкіндік береді. FISH диагностикалық мақсаттарда бірден түрді анықтау қажет болған жағдайларда, әсіресе қан егінін зерттеуде мақсатына жетті, себебі FISH алдын ала тез диагностика үшін арзан әрі оңай әдіс болып табылады.

Виртуалды кариотип

Виртуалды кариотипілеу – FISH панельдеріне тағы бір тиімді, клиникалық қолжетімді балама болып табылады. Ол бір массивте мыңдаған немесе миллиондаған зондтарды пайдаланып, геномдық деңгейде көшірме санының өзгеруін, бұрынғыдан да жоғары дәлдікпен анықтайды. Қазіргі талдау хромосомалық материалдың жоғалуын немесе пайда болуын ғана анықтай алады, ал транслокациялар және инверсиялар сияқты теңгерілген құрылымдық өзгерістерді, лейкемия мен лимфоманың көптеген түрлерінде кездесетін ерекше аберрацияларды анықтай алмайды.

Спектрлік кариотип

Спектрлік кариотипі – түсті хромосомалардың суреті. Спектрлік кариотипілеу FISH әдісін көптеген түрдегі зондтарды пайдалана отырып жүргізеді, нәтижесінде әрбір хромосома метафаза кезеңінде анық таңбаланады. Осы кариотипілеу түрі хромосомалық ауытқуларды анықтау үшін қолданылады.

Хромосомалардың эволюциясы

FISH хромосомалардың эволюциясын зерттеуге пайдаланылуы мүмкін. Туысқан түрлердің хромосомалары ұқсас болады. Бұл гомологияны гендердің немесе геномның тізбектелуі арқылы, сондай-ақ FISH арқылы анықтауға болады. Мысалы, адам және шимпанзе хромосомалары өте ұқсас, және FISH екі шимпанзе хромосомасы бірігіп, бір адам хромосомасын құрағанын көрсетуге мүмкіндік береді. Сол сияқты, бір-біріне жақын емес түрлердің хромосомалары да ұқсас болады, бірақ арақашықтық артқан сайын хромосомалардың үзілуі және бірігуі мүмкін, нәтижесінде мозаикалық хромосомалар пайда болады. Бұл FISH арқылы керемет түрде көрсетілуі мүмкін (суретті қараңыз).