Флуоресцентная in situ гибридизация: метод генетического тестирования

Введение

Техника генетического тестирования

Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) – это молекулярно-цитогенетический метод, использующий флуоресцентные зонды, которые связываются с определенными участками последовательности нуклеиновой кислоты при высокой степени комплементарности. Метод был разработан биомедицинскими исследователями в начале 1980-х годов для выявления и локализации наличия или отсутствия специфических последовательностей ДНК на хромосомах. Флуоресцентная микроскопия позволяет определить места связывания флуоресцентного зонда с хромосомами. FISH часто применяется для поиска специфических особенностей в ДНК, используемых в генетическом консультировании, медицине и идентификации видов. FISH также может быть использован для обнаружения и локализации специфических РНК-мишеней (мРНК, длинных некодирующих РНК и микроРНК) в клетках, циркулирующих опухолевых клетках и образцах тканей. В этом контексте он позволяет определить пространственно-временные закономерности экспрессии генов в клетках и тканях.

Зонды РНК и ДНК

В биологии зонд – это одноцепочечная ДНК или РНК, комплементарная интересующей нуклеотидной последовательности. РНК-зонды могут быть разработаны для любого гена или любой последовательности внутри гена для визуализации мРНК, lncРНК и миРНК в тканях и клетках. FISH используется для изучения клеточного цикла, в частности интерфазы ядра, для выявления хромосомных аномалий. FISH позволяет анализировать большие серии архивных образцов, значительно облегчая идентификацию конкретной хромосомы путем создания зонда с искусственным хромосомным основанием, который будет притягивать сходные хромосомы. Процесс состоит из трех основных этапов: подготовка ткани (предгибридизация), гибридизация и промывка (постгибридизация). Подготовка ткани начинается со сбора соответствующих срезов ткани для проведения РНК-FISH. Сначала фиксируют клетки, циркулирующие опухолевые клетки (CTC), образцы, залитые в парафин и зафиксированные формалином (FFPE), или замороженные срезы ткани. Наиболее часто используемые фиксаторы – 4% формальдегид или параформальдегид (PFA) в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). После фиксации образцы пермеабилизируют, чтобы обеспечить проникновение реагентов гибридизации. Для повышения проницаемости ткани обычно используют детергенты в концентрации 0,1%, такие как Tween 20 или Triton X 100. Для успешного получения in situ результата крайне важно обеспечить оптимальные условия гибридизации, включая температуру, pH, концентрацию соли и время реакции гибридизации. После проверки всех необходимых условий можно приступать к этапам гибридизации, начиная с добавления специфичного к мишени зонда, состоящего из 20 олигонуклеотидных пар, который гибридизуется с целевой РНК(ами). Раздельные, но совместимые системы усиления сигнала позволяют проводить мультиплексный анализ (до двух мишеней на анализ). Усиление сигнала достигается посредством серии последовательных этапов гибридизации. После этапов гибридизации выполняются этапы промывки. Эти этапы направлены на удаление неспецифических гибридов и избавление от несвязанных молекул зонда из образцов для снижения фонового сигнала. На этом этапе обычно используют промывку этанолом для уменьшения автофлуоресценции в тканях или клетках. В конце анализа образцы ткани визуализируют под флуоресцентным микроскопом, таким как конфокальный флуоресцентный микроскоп и микроскоп Keyence. smFISH, или РНК-FISH с одиночными молекулами, является методом обнаружения и количественной оценки мРНК и других длинных молекул РНК в тонком слое образца ткани. Мишени могут быть надежно визуализированы с помощью нескольких коротких одномаркированных олигонуклеотидных зондов. Связывание до 48 флуоресцентно меченных олигонуклеотидов с одной молекулой мРНК обеспечивает достаточную флуоресценцию для точного обнаружения и локализации каждой целевой мРНК на изображении флуоресцентной микроскопии широкого поля. Зонды, не связывающиеся с целевой последовательностью, не достигают достаточной локализованной флуоресценции, чтобы их можно было отличить от фона. Анализы РНК-FISH с одиночными молекулами могут выполняться в одноплексном или мультиплексном режиме и могут использоваться в качестве последующего эксперимента после количественной ПЦР или одновременно с анализом флуоресцентных антител. Технология имеет потенциальные применения в диагностике рака, нейробиологии, анализе экспрессии генов и компаньон-диагностике.

In biology, a probe is a single strand of DNA or RNA that is complementary to a nucleotide sequence of interest. RNA probes can be designed for any gene or any sequence within a gene for visualization of mRNA, lncRNA and miRNA in tissues and cells. FISH is used by examining the cellular reproduction cycle, specifically interphase of the nuclei for any chromosomal abnormalities. FISH allows the analysis of a large series of archival cases much easier to identify the pinpointed chromosome by creating a probe with an artificial chromosomal foundation that will attract similar chromosomes. The process is done in 3 main procedures: tissue preparation (pre hybridization), hybridization, and washing (post hybridization). The tissue preparation starts by collecting the appropriate tissue sections to perform RNA FISH. First, cells, circulating tumor cells (CTCs), formalin fixed paraffin embedded (FFPE), or frozen tissue sections are fixed. Some commonly used fixatives are 4% formaldehyde or paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS). After fixation, samples are permeabilized to allow the penetration of hybridization reagents. The use of detergents at a 0.1% concentration is commonly used to enhance the tissue permeability such as Tween 20 or Triton X 100. It is critical for the hybridization process to have all optimal conditions to have a successful in situ result, including temperature, pH, salt concentration, and time of the hybridization reaction. After checking all the necessary conditions, hybridization steps can be started by first adding a target specific probe, composed of 20 oligonucleotide pairs, hybridizes to the target RNA(s). Separate but compatible signal amplification systems enable the multiplex assay (up to two targets per assay). Signal amplification is achieved via series of sequential hybridization steps. After the hybridization steps, washing steps are performed. These steps aim to remove nonspecific hybrids and get rid of unbound probe molecules from the samples to reduce any background signaling. The use of ethanol washes are typically used at this stage to reduce autofluorescence in tissues or cells. At the end of the assay the tissue samples are visualized under a fluorescence microscope such as the confocal fluorescence microscope and the Keyence microscope. or smFISH, is a method of detecting and quantifying mRNA and other long RNA molecules in a thin layer of tissue sample. Targets can be reliably imaged through the application of multiple short singly labeled oligonucleotide probes. The binding of up to 48 fluorescent labeled oligos to a single molecule of mRNA provides sufficient fluorescence to accurately detect and localize each target mRNA in a wide field fluorescent microscopy image. Probes not binding to the intended sequence do not achieve sufficient localized fluorescence to be distinguished from background. Single molecule RNA FISH assays can be performed in simplex or multiplex, and can be used as a follow up experiment to quantitative PCR, or imaged simultaneously with a fluorescent antibody assay. The technology has potential applications in cancer diagnosis, neuroscience, gene expression analysis, and companion diagnostics.

Волокно РЫБ

В альтернативной технике по сравнению с препаратами на интерфазе или метафазе, в fiber-FISH интерфазные хромосомы фиксируются на слайде таким образом, что они растягиваются в прямую линию, а не плотно скручиваются, как в стандартном FISH, или формируют хромосомные территории, как в интерфазном FISH. Это достигается путем приложения механического сдвига вдоль слайда, либо к клеткам, зафиксированным на слайде и затем лизированным, либо к раствору очищенной ДНК. Для этой цели все чаще используется метод, известный как хромосомное расчесывание. Растянутая конформация хромосом позволяет достичь значительно более высокого разрешения – вплоть до нескольких килобаз. Подготовка образцов для fiber-FISH, хотя и кажется концептуально простой, требует определенного мастерства, и эта техника используется в рутинной практике лишь специализированными лабораториями.

Q-FISH

Q FISH сочетает в себе FISH с PNA и компьютерным программным обеспечением для количественной оценки интенсивности флуоресценции. Эта методика широко используется в исследованиях длины теломер.

РЫБЫЙ поток

Flow FISH использует проточную цитометрию для автоматического проведения FISH на основе измерений флуоресценции в каждой клетке.

MA-FISH

В процессе FISH с использованием микрофлюидики (MA FISH) применяется микрофлюидный поток для повышения эффективности гибридизации ДНК, снижая расход дорогостоящих FISH-зондов и сокращая время гибридизации. MA FISH используется для выявления гена HER2 в тканях рака молочной железы.

РЫБЫ

Микроавторадиография FISH — это методика, сочетающая в себе использование радиоактивно меченых субстратов с традиционной FISH для одновременного выявления филогенетических групп и метаболической активности.

Гибридный синтез-РЫБ

Гибридный Fusion FISH (HF FISH) использует первичную аддитивную комбинацию возбуждения/эмиссии флуорофоров для генерации дополнительных спектров посредством процесса маркировки, известного как динамическая оптическая трансмиссия (DOT). Три первичных флуорофора способны генерировать в общей сложности 7 легко обнаруживаемых спектров эмиссии в результате комбинаторной маркировки с использованием DOT. Гибридный Fusion FISH позволяет проводить высокомультиплексный FISH-анализ, ориентированный на клинические онкологические панели. Технология обеспечивает более быструю оценку результатов благодаря эффективным наборам зондов, которые легко обнаруживаются с помощью традиционных флуоресцентных микроскопов.

МЕРФИШ

Мультиплексная устойчивая к ошибкам флуоресцентная in situ гибридизация – это высокомультиплексная версия smFISH. Она использует комбинаторную маркировку, последующую визуализацию и устойчивое к ошибкам кодирование для обнаружения большого количества молекул РНК и определения их пространственной локализации внутри клетки. Обнаружение большого числа молекул РНК позволяет изучать регуляторные сети генов, предсказывать функции аннотированных генов и выявлять закономерности распределения молекул РНК, которые коррелируют с соответствующими им белками.

Рыба-ребёнок

Starfish — это набор программных инструментов, разработанный в 2019 году консорциумом ученых для анализа данных из девяти различных вариантов FISH, поскольку все варианты генерируют один и тот же набор данных — значения экспрессии генов, сопоставленные с координатами x и y в клетке. Программное обеспечение, предназначенное для всех ученых, а не только биоинформатиков, считывает набор изображений, удаляет шумы и идентифицирует молекулы РНК. Этот подход призван установить стандартную схему анализа данных FISH, аналогично анализу данных одноклеточной транскриптомики.

Медицинские применения

Часто родители детей с нарушениями развития хотят получить больше информации о состоянии своего ребенка, прежде чем планировать рождение следующего ребенка. Эти опасения можно развеять с помощью анализа ДНК родителей и ребенка. В случаях, когда причина нарушения развития ребенка не установлена, ее можно попытаться определить, используя методы FISH и цитогенетического анализа. Примеры заболеваний, диагностируемых с помощью FISH, включают синдром Прадера-Вилли, синдром Ангельмана, синдром делеции 22q13, хронический миелолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, синдром "кошачьего крика", синдром Велокардиофациальный и синдром Дауна. FISH сперматозоидов показана мужчинам с аномальным соматическим или мейотическим кариотипом, а также мужчинам с олигозооспермией, поскольку у примерно 50% мужчин с олигозооспермией отмечается повышенная частота аномалий хромосом сперматозоидов. Анализа хромосом 21, X и Y достаточно для выявления мужчин с олигозооспермией, находящихся в группе риска.

Идентификация вида

FISH широко изучается как метод диагностики для идентификации патогенов в области медицинской микробиологии. Хотя его эффективность и применимость доказаны, он все еще не получил широкого распространения в диагностических лабораториях. Быстрое время получения результата (менее 2 часов) являлось значительным преимуществом по сравнению с биохимической дифференциацией, однако это преимущество оспаривается MALDI TOF MS, который позволяет идентифицировать более широкий спектр патогенов, чем традиционные биохимические методы. Применение FISH в диагностике оправдано, когда требуется немедленная идентификация вида, особенно при исследовании гемокультур, где FISH представляет собой недорогой и простой метод для предварительной быстрой диагностики.

Виртуальный кариотип

Виртуальный кариотипинг – это еще одна экономически выгодная, клинически доступная альтернатива FISH-панелям, использующая тысячи или миллионы зондов на одном чипе для выявления изменений числа копий ДНК, охватывающих весь геном, с беспрецедентным разрешением. В настоящее время этот вид анализа позволяет обнаруживать только приобретения и потери хромосомного материала, но не способен выявлять сбалансированные перестройки, такие как транслокации и инверсии, которые являются типичными аберрациями, наблюдаемыми при многих типах лейкемии и лимфомы.

Спектральный кариотип

Спектральный кариотипинг – это изображение окрашенных хромосом. Спектральный кариотипинг включает в себя FISH с использованием множества вариантов различных типов зондов, что позволяет визуализировать каждую хромосому, помеченную на стадии метафазы. Этот тип кариотипирования используется, в частности, для выявления перестроек хромосом.

Эволюция хромосом

РЫБИ (флуоресцентная in situ гибридизация) может быть использована для изучения эволюции хромосом. У родственных видов наблюдается сходство хромосом. Эта гомология может быть выявлена с помощью секвенирования генов или геномов, а также методом FISH. Например, хромосомы человека и шимпанзе очень похожи, и FISH позволяет продемонстрировать, что две хромосомы шимпанзе слились, образовав одну хромосому человека. Аналогично, у более далёко родственных видов также наблюдается сходство хромосом, но с увеличением эволюционного расстояния хромосомы склонны к разрывам и слияниям, что приводит к образованию мозаичных хромосом. Это можно наглядно продемонстрировать с помощью FISH (см. рисунок).