Үштік спиральды ДНК құрылымы және оның қолданылуы

Кіріспе

ДНК құрылымы

Үш тізгілі ДНК (сонымен қатар H ДНК немесе үштік ДНК деп белгілі) – үш олигонуклеотид бір-біріне оралып, үштік спираль құрайтын ДНК құрылымы. Үш тізгілі ДНК-да үшінші тізгі B формасындағы ДНК-ға (Уотсон-Крик жұптасуы арқылы) Хогстин негіздері немесе кері Хогстин сутекті байланыстары арқылы екі тізгілі спиральмен байланысады.

Құрылымы

Табиғи көздерден алынған, базалық құрамы мен құрылымдық элементтерінің қажетті үйлесіміне ие үш тізбекті ДНК мысалдары сипатталған, мысалы, спутниктік ДНК-да.

Хогстин негіздері

Тимин (T) нуклеобазасы Ватсон-Крик жұптасуы бойынша Т-А байланысына Хогстин сутекті байланысын қалыптастыру арқылы қосылуы мүмкін. Тимин түпнұсқалық екі тізбекті ДНК-ның аденозинімен (А) сутекті байланыс арқылы байланысып, Т-А*Т негіздік үштік құрайды.

Молекулааралық және молекулалық ішкі өзара әсерлесулер

Триплекс ДНК-ның екі класы бар: молекулааралық және молекулаішілік формациялар. Молекулааралық триплекс – ДНК-ның дуплексі мен басқа (үшінші) тізбегі арасындағы триплекс түзілуін білдіреді. Үшінші тізбек көрші хромосомадан немесе триплекс құрайтын олигонуклеотидтен (ТФО) болуы мүмкін. Молекулаішілік триплекс ДНК гомопурин және гомопиримидин тізбектері бар дуплекстен түзіледі, олар айналы қайталану симметриясына ие. ДНҚ-ның суперкоилдену дәрежесі молекулаішілік триплекс түзілу мөлшеріне әсер етеді. Молекулаішілік үштік ДНК-ның екі түрі бар: H ДНК және H* ДНК. H ДНК-ның түзілуі қышқылдық жағдайларда және Mg2+ сияқты еківалентті катиондардың қатысуымен тұрақтандырылады. Бұл конформацияда дуплекстегі гомопиримидин тізбегі пурин тізбегімен қатарласып байланысу үшін кері иіледі. Бұл конформацияны тұрақтандыру үшін қолданылатын негіз триадалары T A*T және C G*A+. Бұл базалық триаданың цитозині осы молекулаішілік үштік спиральді қалыптастыру үшін протондануы керек, сондықтан бұл конформация қышқылдық жағдайларда тұрақтандырылады. H* ДНК бейтарап pH-та және еківалентті катиондардың қатысуымен қалыптасуына қолайлы жағдай жасайды. ТФО-лар көбінесе гендердің промоторлық және интрон тізбектерінде кездесетін гомопуриндік-гомопиримидиндік аймақтарға ерекше байланысады, бұл жасушалық сигнализацияға әсер етеді. ТФО ДНК спиралімен жоғары ерекшелікпен байланысу арқылы транскрипцияны тежеуі мүмкін, осылайша белгілі бір тізбектер үшін транскрипция факторларының байланысуы мен қызметін бұзады. ТФО-ны жасушаға енгізу арқылы (трансфекция немесе басқа тәсілдер арқылы) белгілі бір гендердің экспрессиясын бақылауға болады. Бұл қолданбаның сайтқа тән мутагенезге және гендік терапияға жаңа әсері бар. Адамның простатадағы қатерлі ісік жасушаларында Ets2 транскрипциялық факторы аса экспрессияланады және мұндай артық жасушалардың өсуі мен тіршілігін алға жетелейді деп есептеледі. Карбон және авторлар тобы Ets2 промотор тізбегіне тән TFO тізбегін жобалады, ол ген экспрессиясын төмендетіп, жасушалардың өсуін және өлімін баяулатты. Чансян және авторлар тобы bcl 2 промотор тізбегін нысанаға алған TFO ұсынды, бұл апоптозды тежейтін ген. Транскрипцияның байқалған тежелуі Фридрейх атаксиясы үшін рецессивті, аутосомалық гендегі рөлі сияқты денсаулыққа кері әсерін тигізуі мүмкін. Фредрик атаксиясында триплекс ДНК-ның пайда болуы FXN генінің 1-інтроны экспрессиясын бұзады. Бұл жүйке жүйесі мен омыртқа миының бұзылуына әкеліп соғады, бұл аяқ-қолдың қозғалысын бұзады. Бұл триплекс тұрақсыздығына қарсы күресу үшін нуклеотидтерді жөндеу ақуыздары (НЭР) үштік ДНК құрылымдарын таниды және қалпына келтіреді, бұл бұрын тежелген және тұрақсыз геннің толық қолжетімділігін қалпына келтіреді.

There are two classes of triplex DNA: intermolecular and intramolecular formations. An intermolecular triplex refers to triplex formation between a duplex and a different (third) strand of DNA. The third strand can either be from a neighboring chromosome or a triplex forming oligonucleotide (TFO). Intramolecular triplex DNA is formed from a duplex with homopurine and homopyrimidine strands with mirror repeat symmetry. The degree of supercoiling in DNA influences the amount of intramolecular triplex formation that occurs. There are two different types of intramolecular triplex DNA: H DNA and H* DNA. Formation of H DNA is stabilized under acidic conditions and in the presence of divalent cations such as Mg2+. In this conformation, the homopyrimidine strand in the duplex bends back to bind to the purine strand in a parallel fashion. The base triads used to stabilize this conformation are T A*T and C G*A+. The cytosine of this base triad needs to be protonated in order to form this intramolecular triple helix, which is why this conformation is stabilized under acidic conditions. H* DNA has favorable formation conditions at neutral pH and in the presence of divalent cations. TFOs bind specifically to homopurine homopyrimidine regions that are often common in promoter and intron sequences of genes, influencing cell signaling. TFOs can inhibit transcription by binding with high specificity to the DNA helix, thereby blocking the binding and function of transcription factors for particular sequences. By introducing TFOs into a cell (through transfection or other means), the expression of certain genes can be controlled. This application has novel implications in site specific mutagenesis and gene therapy. In human prostate cancer cells, a transcription factor Ets2 is over expressed and thought to drive forward the growth and survival of cells in such excess. Carbone et al. designed a sequence specific TFO to the Ets2 promoter sequence that down regulated the gene expression and led to a slowing of cell growth and cell death. Changxian et al. have also presented a TFO targeting the promoter sequence of bcl 2, a gene inhibiting apoptosis. The observed inhibition of transcription can also have negative health effects like its role in the recessive, autosomal gene for Friedreich's Ataxia. In Fredrick's Ataxia, triplex DNA formation impairs the expression of intron 1 of the FXN gene. This results in the degeneration of the nervous system and spinal cord, impairing the movement of the limbs. To combat this triplex instability, nucleotide excision repair proteins (NERs) have been shown to recognize and repair triple stranded DNA structures, reinstating full availability of the previously inhibited and unstable gene.

Пептидтік нуклеин қышқылдары (ПНҚ)

Пептидтік нуклеин қышқылдары – протеаздың ыдырауына төзімді синтетикалық олигонуклеотидтер, олар ДНК геномдық сайттарындағы нақты триплекс түзілу аймақтарында жөндеуді іске қосу үшін қолданылады. PNA-лар Уотсон-Крик негіз жұптасуы арқылы толыққанды ДНК тізбектеріне жоғары сәйкестік және тізбек ерекшелігімен байланыса алады және PNA-ның ДНК-ның 5’ ұшына қаратылған параллель бағыттағы Хугстин байланыстары арқылы үштік спираль құра алады. PNA-ДНК триплексі тұрақты, себебі PNA-лар екі тізбекті ДНК-ға (dsDNA) байланысатын бейтарап зарядталған псевдопептидтік тірекшеден тұрады. TFO-дағы гомопиримидинге ұқсас, PNA-дағы гомопиримидин dsDNA-ның мақсатты тізбегіндегі толыққанды гомопуринмен байланысқа түседі. Бұл ДНК аналогтары қоршаған ДНК жағдайларын және танудың әртүрлі болжамдық режимдерін пайдалану арқылы dsDNA-ға байланыса алады. Бұл dsDNA-ның негізгі ойығын тану арқылы байланысатын TFO-дан өзгеше. Дюплекстік инвазияның бұл түрі гомопуринді PNA олигомерлерінің толыққанды тізбегі арқылы жүзеге асады. Бұл триплекс PNA-ДНК гибридінен құрылады, ол антипараллель толыққанды ДНК тізбегімен байланысады және толыққанды емес ДНК тізбегінің ығысуына әкеледі. Бис PNA құрылымы мақсатты жерде PNA-ДНК-PNA триплексін құрайды, онда бір тізбек антипараллель бағытта ДНК-мен Уотсон-Крик негіз жұптарын құрайды, ал екінші тізбек ДНК-PNA дуплексіндегі гомопуринді ДНК тізбегімен Хугстин негіз жұптарын құрайды.

Гендік экспрессия

Бірнеше жарияланған мақалаларға сәйкес, H ДНК орналасқан жері және жақын орналасқан тізбектер сияқты факторларға байланысты ген экспрессиясын реттеуге қабілетті. Прокариоттық геномның интергендік аймақтарында табиғи H ДНК немесе триплекс мотивтерінің аз ғана іздері табылды, бірақ H ДНК құрылымдары эукариоттық геномда жиірек кездеседі. H ДНК сүтқоректілердің жасушаларында, соның ішінде адамдарда кең таралған (әр 50 000 бп-ға 1 бп). Эукариоттық геном экспрессиясын зерттеу in vitro және in vivo жағдайында үш нәтижеге әкелді: ген экспрессиясының жоғарылауы, төмендеуі немесе өзгеріссіз қалуы. H ДНК қатысуымен генетикалық тізбектің геномдық экспрессиясына байланысты басқа механизмдерге TFO жатады. In vitro зерттеулер сүтқоректілердің жасушаларында TFO болғанда ген экспрессиясының төмендегенін көрсетті. Валентина және авторлар ұсынған тағы бір мүмкіндік – 13-мерлі AG мотивті олигонуклеотидтік триплекс кешені (TFO кешені) бәсекелестік тежеу арқылы мРНК транскрипциясын төмендетеді. H ДНК-дан ген экспрессиясын тікелей тежеу мутагенезді, репликацияны тежеуді және тіпті геномдағы ДНК рекомбинациясын тудыруы мүмкін. Эукариоттарда H ДНК мотивтері қатысатын гомологтық рекомбинация да анықталды. RecA-ның гомологтық протеині RadA рекомбинация кезінде RecA-мен бірдей ферменттік белсенділікке ие екені көрсетілді. Бұл протеин параллель үштік спиральдар арқылы гомологтық жіптерді жылжытуға және алмастыруға қабілетті. Бір жіпті ДНК (ssDNA) және қосар жіпті ДНК (dsDNA) бірге D-тұйық құрылымын жасайды. c MYC генінің P1 промоторының жанында H ДНК құратын полипуриндік айна қайталау тізбектері табылды және бұл аймақтың негізгі үзілу ошақтарымен байланысты. Трансгенді тышқандардың F1 ұрпақтарында, бұрын тұрақсыздық туралы хабарланбаған геномдарына Z ДНК тізбектерімен жұптастырылған адам H ДНК құратын тізбектер енгізілгеннен кейін генетикалық тұрақсыздық жағдайлары байқалды. Сонымен қатар, bcl 2 генінің Mbr аймағында R.R.Y. H ДНК конформацияларының пайда болуы байқалды. Бұл құрылымдардың пайда болуы көптеген қатерлі ісіктер мен фоликулярлы лимфомаларда байқалатын t(14;18) транслокациясын тудыруы мүмкін деп болжанады. Бұл байқау осы аймақтың тізбесін сәл өзгертіп, H ДНК түзілуін тоқтату арқылы транслокация оқиғаларының айтарлықтай төмендеуін көрсететін зерттеулерге әкелді. GAA·TTC-нің ұзын тізбектері өте тұрақты H ДНК құрылымдарын құрайтыны анықталды. Осы екі H ДНК құрылымы арасындағы өзара әрекеттесулер, «жабысқақ ДНК» деп аталады, X25 немесе фратаксин генінің транскрипциясын тоқтатуы мүмкін. Фратаксин протеинінің деңгейі төмендегенде Фридрейх атаксиясы пайда болады, сондықтан осы тұрақсыздықтың пайда болуы осы генетикалық аурудың себебі болуы мүмкін. Үштік жіптік ДНК суперспиральдік спутниктік ДНК аймақтарында, микросателлиттердің көшірмелерінің саны өте өзгермелі болған жерде және үлкен 2.1 кб спутниктік ДНК қайталау бірлігінің ішінде инверттік қайталау Z ДНК құрылымдарымен бірге байқалды. Сонымен қатар, H ДНК ДНК репликациясы және транскрипциясы сияқты маңызды жасушалық процестерге байланысты мутацияларды тудыруы мүмкін. Әртүрлі нуклеазалардың H ДНК-мен репликацияға тәуелді немесе тәуелсіз түрде өзара әрекеттесетіні көрсетілді. Бұл ферменттер екі Хогстин сутекті байланысы бар жіптер мен басқа Уотсон-Крик сутекті байланысы бар жіптің 5' ұшынан құралған циклде H ДНК-ны кеседі. H ДНК осы зақымданулардың бірі ретінде қарастырылуы мүмкін. Тұрақты H ДНК құратын тізбектің аналогында T7 РНК полимеразасының транскрипциясын бақылау зерттеуінде дуплекстен триплекске дейінгі тұйықтауда транскрипция тоқтатылды. Бұл жағдайда шаблондық жіп H ДНК-ның орталық жіпі болды, ал оның Уотсон-Крик және Хогстин сутекті байланыстарын бұзу қиындығы транскрипцияның дамуын тоқтатты. c MYC генінің P0 промоторында T7 транскрипциясы байқалғанда, табылған қысқарған транскрипция өнімдері транскрипцияның промотордан төменгі H ДНК құратын тізбекке жақын жерде тоқтатылғанын көрсетті. Бұл аймақта H ДНК-ның пайда болуы T7-нің стереокедергісіне байланысты шаблондық жіпке қарай жылжуына кедергі келтіреді. Бұл транскрипцияны тоқтатады және H ДНК-ны ажырату үшін TCR факторларын шақырады, бұл генетикалық тұрақсыздыққа әкелуі мүмкін ДНК-ны кесуге әкеледі. Бұл, транскрипция кезінде TCR факторларының белсенділігімен бірге, оны жоғары мутагенді етеді, ол Буркитт лимфомасы мен лейкемияның дамуында рөл атқарады. Мутагендерге бекітілген TFO-лар ДНК зақымдануын күшейтуге және мутагенезді тудыруы мүмкін. Гематопоэздік стемдік жасушаларды in vivo бағыттаудағы бір зерттеуде PNA молекулаларын жасушаға енетін пептидтермен (CPPs) және поли(лактивтік ко-гликольдік қышқыл) (PLGA) нанобөлшектерімен біріктірудің жаңа әдісі ұсынылды, бұл CCR5 генінде 6 бп өзгерістерге мүмкіндік береді. CCR5 генінің өңделуі HIV-1 резистенттілігімен байланысты. CPP – бұл шағын протеиндер немесе молекулаларды жасушаларға сәтті жеткізе алатын протеиндер. PLGA – бұл PNA молекулаларын нанобөлшектер ретінде капсулалайтын биодеградацияланатын материал, ол геномды нақты өзгертуге мүмкіндік береді. F508 del мутациясы – бұл адамның кістік фиброзына (CF) шалдығуына себеп болатын ең көп кездесетін мутация. F508 мутациясы CFTR-дың функциясын жоғалтуға әкеледі, бұл циклоаденозин монофосфат (cAMP) реттелетін плазмалық мембрана хлоридтік каналы. Бұл зерттеуде, олар нанобөлшектерді пайдаланып CF-қа жаңа емдеу әдісін жасауға қол жеткізді, бұл in vitro жағдайында адам бронхтық эпителий (HBE) жасушаларында және in vivo CF тышқан моделінде F508 del CFTR мутациясын түзетуге мүмкіндік берді, нәтижесінде CFTR-ға тәуелді хлоридтік тасымалдау пайда болды. Фрейзер де осы мәселемен айналысты. Алайда, Уотсон мен Крик осы модельдермен бірнеше мәселелерді анықтады: Остің жанындағы теріс зарядталған фосфаттар бір-бірін итермелейді, сондықтан үш тізбекті құрылым қалай тұрақты болатыны белгісіз. Үштік спираль модельінде (әсіресе Поулинг пен Коридің моделінде) Ван дер Ваальс қашықтықтарының кейбіреуі тым кішкентай болып көрінеді. Фрейзердің моделі Поулинг пен Коридің моделінен фосфаттар сыртқа, ал негіздер ішке қарай бағытталғандығымен ерекшеленеді, олар сутекті байланыстар арқылы байланысқан. Алайда, Уотсон мен Крик Фрейзердің моделінің жеткіліксіз анықталғандығын айтты, сондықтан оның кемшіліктері туралы нақты пікір білдіре алмады. Басқаша үштік жіптік ДНК құрылымы 1957 жылы сипатталды. Фельзенфельд, Дэвис және Рич, егер бір тізбекте тек пуриндер, ал екінші тізбекте тек пуриндер болса, тізбек үштік спиральдік ДНК спиралін құру үшін конформациялық өзгеріске ұшырайтынын болжады. Үштік жіптік ДНК (H ДНК) бір полипуриндік және екі полипиримидиндік тізбектен тұрады деп болжалды. Сонымен қатар, гомопиримидин және кейбір пуринге бай олигонуклеотидтер ДНК дуплексіндегі гомопурин-гомопиримидин байланыс тізбектеріне қатысты тұрақты H ДНК құрылымын құруға қабілетті екені жақын арада анықталды.

According to several published articles, H DNA has the ability to regulate gene expression depending on factors such as location and sequences in proximity. Although intergenic regions of the prokaryotic genome have shown low traces of naturally occurring H DNA or triplex motifs, H DNA structures have shown to be more prevalent in the eukaryotic genome. H DNA has been shown to be especially abundant in mammalian cells including humans (1 in every 50,000 bp). In vitro and in vivo studies of eukaryotic genome expression resulted in one of three results: up regulation, down regulation, or no change in the presence of H DNA motifs. Other mechanisms associated with the genomic expression of a genetic sequence in the presence of H DNA involves TFOs. In vitro studies have highlighted a decrease in gene expression in the presence of TFOs in mammalian cells. Another possible mechanism presented by Valentina et al. suggest the 13 mer AG motif oligonucleotide triplex complex (TFO complex) downregulates the transcription of mRNA through competitive inhibition. Direct inhibition of gene expression from H DNA is key to mutagenesis, replication inhibition, and even DNA recombination in the genome. Homologous recombination involving H DNA motifs have also been found in eukaryotes. RadA, a homologous protein to RecA, has been shown to have the same enzymatic activity in recombination as RecA. The protein has the ability to promote and exchange homologous strands through parallel triple stranded helices. The single stranded DNA (ssDNA) and complementary double stranded DNA (dsDNA) will form a D loop structure. Polypurine mirror repeat H DNA forming sequences were found neighboring the P1 promoter of the c MYC gene and are associated with the major breakpoint hotspots of this region. Cases of genetic instability were also observed in the F1 offspring of transgenic mice after incorporation of human H DNA forming sequences paired with Z DNA sequences into their genomes where no instability was previously reported. Additionally, formation of R. R. Y. H DNA conformations have been observed at the Mbr of the bcl 2 gene. Formation of these structures has been posited to cause the t(14;18) translocation observed in many cancers and most follicular lymphomas. This observation has led to research that indicated a substantial decrease in translocation events can be observed after blocking the formation of H DNA by altering the sequence of this region slightly. Long tracts of GAA·TTC have also been observed to form very stable H DNA structures. Interactions between these two H DNA structures, termed sticky DNA, has been shown to interrupt transcription of the X25, or frataxin gene. As decreased levels of the protein frataxin is associated with Friedreich's ataxia, formation of this instability has been suggested to be the basis for this genetic disease. Triple stranded DNA has been observed in supercoiled Satellite DNA in regions where microsatellite copy numbers are highly variable, along with inverted repeat Z DNA structures within a larger 2.1kb satellite DNA repeat unit. Additionally, H DNA has been shown to cause mutations related to critical cellular processes like DNA replication and transcription. Various nucleases have been shown to interact with H DNA in a replication dependent or replication independent manner. These enzymes cleave H DNA at the loop formed by the two Hoogsteen hydrogen bonded strands and the 5' end of the other Watson Crick hydrogen bonded strand, respectively. H DNA can be perceived as one of these lesions. A study observing transcription by T7 RNA polymerase on a stable H DNA forming sequence analog found transcription blockage at the duplex to triplex junction. Here, the template strand was the central strand of the H DNA, and the difficulty of disrupting its Watson Crick and Hoogsteen hydrogen bonds stopped transcription from progressing. When transcription by T7 was observed on the P0 promoter of the c MYC gene, the shortened transcription products that were found indicated that transcription was stopped in close proximity to the H DNA forming sequence downstream of the promoter. Formation of H DNA in this region prevents T7 from traveling down the template strand because of the steric hindrance it causes. This stops transcription and signals for TCR factors to come resolve the H DNA, which results in DNA excision that can cause genetic instability. This coupled with the activity of TCR factors during transcription makes it highly mutagenic, with it playing a role in the development of Burkitt lymphoma and leukemia. TFOs tethered to mutagens have also been shown to promote DNA damage and induce mutagenesis. One study on in vivo targeting of hematopoietic stem cells proposed a novel technique of conjugating PNA molecules with cell penetrating peptide (CPPs) alongside poly(lactic co glycolic acid) (PLGA) nanoparticles to enable 6 bp modifications in the CCR5 gene. The editing of the CCR5 gene has been linked to HIV 1 resistance. CPPs are proteins that are able to carry “cargo” such as small proteins or molecules successfully into cells. The PGLAs are biodegradable material that encapsulate PNA molecules as nanoparticles for site specific genome modifications. The F508 del mutation is the most commonly occurring mutation which leads a person to have CF. The F508 mutation leads to a loss of function of the CFTR, which is a plasma membrane chloride channel that is regulated by a cyclic adenosine monophosphate(cAMP). In this study, they were able to create the novel treatment approach for CF through the use of nanoparticles to correct the F508 del CFTR mutation both in vitro in human bronchial epithelial (HBE) cells and in vivo in a CF mouse model which resulted in the appearance of CFTR dependent chloride transport. as well as fellow scientist Fraser. However, Watson and Crick soon identified several problems with these models:
Negatively charged phosphates near the axis repel each other, leaving the question of how the three chain structure stays together. In a triple helix model (specifically Pauling and Corey's model), some of the van der Waals distances appear to be too small. Fraser's model differed from Pauling and Corey's in that in his model the phosphates are on the outside and the bases are on the inside, linked together by hydrogen bonds. However, Watson and Crick found Fraser's model to be too ill defined to comment specifically on its inadequacies. An alternative triple stranded DNA structure was described in 1957. Felsenfeld, Davies, and Rich predicted that if one strand contained only purines and the other strand only purines, the strand would undergo a conformational change to form a triple stranded DNA helix. The triple stranded DNA (H DNA) was predicted to be composed of one polypurine and two polypyrimidine strands. Additionally, it was soon found that homopyrimidine and some purine rich oligonucleotide are able form a stable H DNA structure with the homopurine homopyrimidine binding sequence specific structures on the DNA duplexes.