Тройная спираль ДНК: структура, формирование и применение.

Введение

Структура ДНК

Тройная спираль ДНК (также известная как H-ДНК или Triplex ДНК) — это структура ДНК, в которой три олигонуклеотида закручиваются друг вокруг друга, формируя тройную спираль. В тройной спиральной ДНК третья цепь связывается с двухцепочечной ДНК формы B (через ватсоновско-криковское спаривание оснований), образуя пары оснований Гугстейна или обратные водородные связи Гугстейна.

Структура

Примеры трехцепочечной ДНК из природных источников, обладающих необходимой комбинацией базового состава и структурных элементов, были описаны, например, в спутниковой ДНК.

Базовая парная система Hoogsteen

Нуклеобаза тимина (T) может образовывать водородную связь типа Хугстина и связываться с парой оснований Уотсона — Крика T-A. Тимин образует водородные связи с аденозином (A) исходной двухцепочечной ДНК, формируя базовый триплет T-A-T.

Межмолекулярные и внутримолекулярные взаимодействия

Существует два класса триплексной ДНК: межмолекулярные и внутримолекулярные формации. Межмолекулярный триплекс относится к образованию триплекса между дуплексом и другой (третьей) цепью ДНК. Третья цепь может быть либо из соседней хромосомы, либо из триплекс-образующего олигонуклеотида (TFO). Внутримолекулярная триплексная ДНК образуется из дуплекса с гомопуриновыми и гомопиримидиновыми цепями с зеркальной повторяющейся симметрией. Степень суперспирализации ДНК влияет на количество образующихся внутримолекулярных триплексов. Существует два различных типа внутримолекулярной тройной ДНК: H-ДНК и H*-ДНК. Формирование H-ДНК стабилизируется в кислых условиях и в присутствии двухвалентных катионов, таких как Mg2+. В этой конформации гомопиримидиновая цепь в дуплексе изгибается назад, чтобы связаться с пуриновой цепью параллельным образом. Основные триады, используемые для стабилизации этой конформации, – T A*T и C G*A+. Цитозин в этой базовой триаде должен быть протонирован для формирования этой внутримолекулярной тройной спирали, поэтому эта конформация стабилизируется в кислых условиях. H*-ДНК имеет благоприятные условия формирования при нейтральном pH и в присутствии двухвалентных катионов. TFO связываются специфически с гомопуриновыми гомопиримидиновыми участками, которые часто встречаются в промоторных и интронных последовательностях генов, влияя на клеточную сигнализацию. TFO могут ингибировать транскрипцию, связываясь с высокой специфичностью с ДНК-спиралью, тем самым блокируя связывание и функцию факторов транскрипции для определенных последовательностей. Введение TFO в клетку (путем трансфекции или другими способами) позволяет контролировать экспрессию определенных генов. Это применение имеет новые перспективы в сайт-специфическом мутагенезе и генной терапии. В клетках рака предстательной железы человека транскрипционный фактор Ets2 сверхэкспрессируется и, как считается, стимулирует рост и выживание клеток. Carbone et al. разработали TFO, специфичный к промоторной последовательности Ets2, который снижал экспрессию гена и приводил к замедлению роста клеток и их гибели. Changxian et al. также представили TFO, нацеленный на промоторную последовательность bcl-2, гена, ингибирующего апоптоз. Наблюдаемое ингибирование транскрипции также может иметь негативные последствия для здоровья, например, его роль в рецессивном аутосомном гене, ответственном за атаксию Фридрейха. При атаксии Фридрейха образование триплексной ДНК нарушает экспрессию интрона 1 гена FXN. Это приводит к дегенерации нервной системы и спинного мозга, нарушая подвижность конечностей. Для борьбы с этой нестабильностью триплекса было показано, что белки нуклеотидной эксцизионной репарации (NER) распознают и восстанавливают трехцепочечные структуры ДНК, восстанавливая полную доступность ранее ингибированного и нестабильного гена.

There are two classes of triplex DNA: intermolecular and intramolecular formations. An intermolecular triplex refers to triplex formation between a duplex and a different (third) strand of DNA. The third strand can either be from a neighboring chromosome or a triplex forming oligonucleotide (TFO). Intramolecular triplex DNA is formed from a duplex with homopurine and homopyrimidine strands with mirror repeat symmetry. The degree of supercoiling in DNA influences the amount of intramolecular triplex formation that occurs. There are two different types of intramolecular triplex DNA: H DNA and H* DNA. Formation of H DNA is stabilized under acidic conditions and in the presence of divalent cations such as Mg2+. In this conformation, the homopyrimidine strand in the duplex bends back to bind to the purine strand in a parallel fashion. The base triads used to stabilize this conformation are T A*T and C G*A+. The cytosine of this base triad needs to be protonated in order to form this intramolecular triple helix, which is why this conformation is stabilized under acidic conditions. H* DNA has favorable formation conditions at neutral pH and in the presence of divalent cations. TFOs bind specifically to homopurine homopyrimidine regions that are often common in promoter and intron sequences of genes, influencing cell signaling. TFOs can inhibit transcription by binding with high specificity to the DNA helix, thereby blocking the binding and function of transcription factors for particular sequences. By introducing TFOs into a cell (through transfection or other means), the expression of certain genes can be controlled. This application has novel implications in site specific mutagenesis and gene therapy. In human prostate cancer cells, a transcription factor Ets2 is over expressed and thought to drive forward the growth and survival of cells in such excess. Carbone et al. designed a sequence specific TFO to the Ets2 promoter sequence that down regulated the gene expression and led to a slowing of cell growth and cell death. Changxian et al. have also presented a TFO targeting the promoter sequence of bcl 2, a gene inhibiting apoptosis. The observed inhibition of transcription can also have negative health effects like its role in the recessive, autosomal gene for Friedreich's Ataxia. In Fredrick's Ataxia, triplex DNA formation impairs the expression of intron 1 of the FXN gene. This results in the degeneration of the nervous system and spinal cord, impairing the movement of the limbs. To combat this triplex instability, nucleotide excision repair proteins (NERs) have been shown to recognize and repair triple stranded DNA structures, reinstating full availability of the previously inhibited and unstable gene.

Пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК)

Пептидные нуклеиновые кислоты – это синтетические олигонуклеотиды, устойчивые к деградации протеазами, и используемые для индукции репарации в специфических участках генома ДНК, где формируются триплексы. PNA способны связываться с высокой аффинностью и последовательной специфичностью с комплементарной последовательностью ДНК посредством образования пар оснований Уотсона-Крика и формировать тройные спирали за счет параллельной ориентации связей Хугстина, при которой PNA обращена к 5'-концу цепи ДНК. Триплекс ДНК-PNA стабилен, поскольку PNA состоят из нейтрально заряженного псевдопептидного каркаса, который связывается с двухцепочечной последовательностью ДНК (dsDNA). Аналогично гомопиримидинам в TFO, гомопиримидины в PNA способны образовывать связь с комплементарным гомопурином в целевой последовательности dsDNA. Эти аналоги ДНК способны связываться с dsDNA, используя существующие условия в ДНК и различные механизмы распознавания. Это отличается от TFO, которые связываются посредством распознавания по большой бороздке dsDNA. Такое вторжение в дуплекс достигается за счет комплементарной последовательности гомопуриновых олигомеров PNA. Этот триплекс формируется из гибрида ДНК-PNA, который связывается антипараллельно с комплементарной последовательностью ДНК, что приводит к вытеснению некомплементарной цепи ДНК. Bis-PNA структура формирует триплекс PNA-ДНК-PNA в целевом участке, где одна цепь образует пары оснований Уотсона-Крика с ДНК в антипараллельной ориентации, а другая цепь образует пары оснований Хугстина с гомопуриновой цепью ДНК в дуплексе ДНК-PNA.

Экспрессия генов

Согласно нескольким опубликованным статьям, H-ДНК обладает способностью регулировать экспрессию генов в зависимости от таких факторов, как локализация и соседние последовательности. Хотя межгенные области генома прокариот демонстрируют незначительное количество естественно встречающейся H-ДНК или триплексных мотивов, структуры H-ДНК оказались более распространёнными в геноме эукариот. Показано, что H-ДНК особенно обильна в клетках млекопитающих, включая человека (1 на каждые 50 000 п.н.). Исследования экспрессии генома эукариот in vitro и in vivo приводили к одному из трех результатов: повышение экспрессии, понижение экспрессии или отсутствие изменений в присутствии мотивов H-ДНК. Другие механизмы, связанные с геномной экспрессией генетической последовательности в присутствии H-ДНК, включают TFO. Исследования in vitro выявили снижение экспрессии генов в присутствии TFO в клетках млекопитающих. Другой возможный механизм, предложенный Валентиной и др., заключается в том, что 13-мерный олигонуклеотидный триплекс AG-мотива (комплекс TFO) подавляет транскрипцию мРНК посредством конкурентного ингибирования. Прямое ингибирование экспрессии генов H-ДНК играет ключевую роль в мутагенезе, ингибировании репликации и даже рекомбинации ДНК в геноме. Гомологичная рекомбинация с участием мотивов H-ДНК также была обнаружена у эукариот. Показано, что RadA, гомологичный белок RecA, обладает той же ферментативной активностью в рекомбинации, что и RecA. Белок способен способствовать обмену гомологичными цепями через параллельные трехцепочечные спирали. Одноцепочечная ДНК (ssDNA) и комплементарная двухцепочечная ДНК (dsDNA) образуют структуру D-петли. Полипуриновые зеркальные повторы, формирующие последовательности H-ДНК, были обнаружены вблизи промотора P1 гена c-MYC и связаны с основными точками разрыва в этой области. Случаи генетической нестабильности также наблюдались у потомства F1 трансгенных мышей после включения последовательностей, формирующих человеческую H-ДНК, в сочетании с последовательностями Z-ДНК в их геномы, где ранее нестабильность не сообщалась. Кроме того, было отмечено образование конформаций ДНК R.R.Y.H в Mbr гена bcl-2. Считается, что формирование этих структур вызывает транслокацию t(14;18), наблюдаемую при многих раковых заболеваниях и большинстве фолликулярных лимфом. Это наблюдение привело к исследованиям, которые показали, что существенное снижение транслокационных событий можно наблюдать после блокирования образования H-ДНК путем незначительного изменения последовательности этой области. Также было замечено, что длинные участки GAA·TTC образуют очень стабильные структуры H-ДНК. Взаимодействие между этими двумя структурами H-ДНК, называемое «липкой ДНК», было показано, что оно прерывает транскрипцию гена X25 или фратаксина. Поскольку снижение уровня белка фратаксина связано с атаксией Фридрейха, предполагается, что образование этой нестабильности является основой этого генетического заболевания. Тройная спираль ДНК наблюдалась в суперспирализованной спутниковой ДНК в регионах, где количество копий микросателлитов сильно варьируется, наряду с инвертированными повторами Z-ДНК в более крупной 2,1 кб повторяющейся единице спутниковой ДНК. Кроме того, было показано, что H-ДНК вызывает мутации, связанные с критическими клеточными процессами, такими как репликация и транскрипция ДНК. Различные нуклеазы были показаны взаимодействующими с H-ДНК репликационно-зависимым или репликационно-независимым образом. Эти ферменты расщепляют H-ДНК в петле, образованной двумя водородно-связанными цепями Hoogsteen, и на 5'-конце другой цепи, связанной водородными связями Watson-Crick, соответственно. H-ДНК может рассматриваться как одно из этих повреждений. В исследовании, наблюдавшем транскрипцию РНК-полимеразой T7 на стабильном аналоге, формирующем последовательность H-ДНК, была обнаружена блокировка транскрипции на стыке дуплекса и триплекса. Здесь цепь-матрица была центральной цепью H-ДНК, и трудность разрушения ее водородных связей Watson-Crick и Hoogsteen остановила прогрессирование транскрипции. Когда транскрипция T7 наблюдалась на промоторе P0 гена c-MYC, обнаруженные укороченные продукты транскрипции указывали на то, что транскрипция была остановлена в непосредственной близости от формирующей последовательности H-ДНК ниже по течению промотора. Формирование H-ДНК в этой области препятствует продвижению T7 по цепи-матрице из-за стерических препятствий, которые оно создает. Это останавливает транскрипцию и сигнализирует о необходимости разрешения H-ДНК TCR-факторами, что приводит к вырезанию ДНК, которое может вызвать генетическую нестабильность. Это, в сочетании с активностью TCR-факторов во время транскрипции, делает ее высокомутагенной, играя роль в развитии лимфомы Беркитта и лейкемии. TFO, присоединенные к мутагенам, также были показаны способными способствовать повреждению ДНК и индуцировать мутагенез. Одно исследование in vivo нацеливания на гематопоэтические стволовые клетки предложило новый метод конъюгирования молекул PNA с проникающими в клетки пептидами (CPP) наряду с наночастицами поли(молочной кислоты-ко-гликолевой кислоты) (PLGA) для обеспечения 6-пн модификаций в гене CCR5. Редактирование гена CCR5 связано с устойчивостью к ВИЧ-1. CPP — это белки, способные успешно доставлять «груз», такой как небольшие белки или молекулы, в клетки. PLGA — это биоразлагаемый материал, который инкапсулирует молекулы PNA в виде наночастиц для внесения специфических изменений в геном. Мутация F508del является наиболее распространенной мутацией, приводящей к развитию муковисцидоза. Мутация F508 приводит к потере функции CFTR, плазменного мембранного хлоридного канала, регулируемого циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ). В этом исследовании им удалось создать новый подход к лечению муковисцидоза с использованием наночастиц для коррекции мутации F508del CFTR как in vitro в клетках эпителия бронхов человека (HBE), так и in vivo в мышиной модели муковисцидоза, что привело к появлению хлоридного транспорта, зависящего от CFTR. Как и ученый Фрейзер. Однако Уотсон и Крик вскоре выявили несколько проблем с этими моделями: отрицательно заряженные фосфаты вблизи оси отталкиваются друг от друга, что оставляет вопрос о том, как трехцепочечная структура остается вместе. В модели тройной спирали (в частности, модели Полинга и Кори) некоторые ван-дер-ваальсовы расстояния кажутся слишком малыми. Модель Фрейзера отличалась от модели Полинга и Кори тем, что в его модели фосфаты находятся снаружи, а основания — внутри, связанные водородными связями. Однако Уотсон и Крик сочли модель Фрейзера слишком нечеткой, чтобы конкретно комментировать ее недостатки. Альтернативная структура трехцепочечной ДНК была описана в 1957 году. Фельзенфельд, Дэвис и Рич предположили, что если одна цепь содержит только пурины, а другая цепь только пурины, цепь претерпит конформационное изменение, чтобы сформировать трехцепочечную спираль ДНК. Предполагалось, что трехцепочечная ДНК (H-ДНК) состоит из одной полипуриновой и двух полипиримидиновых цепей. Кроме того, вскоре было обнаружено, что гомопиримидиновые и некоторые пурин-богатые олигонуклеотиды способны образовывать стабильную структуру H-ДНК с гомопурин-гомопиримидиновыми связывающими последовательностями на дуплексах ДНК.

According to several published articles, H DNA has the ability to regulate gene expression depending on factors such as location and sequences in proximity. Although intergenic regions of the prokaryotic genome have shown low traces of naturally occurring H DNA or triplex motifs, H DNA structures have shown to be more prevalent in the eukaryotic genome. H DNA has been shown to be especially abundant in mammalian cells including humans (1 in every 50,000 bp). In vitro and in vivo studies of eukaryotic genome expression resulted in one of three results: up regulation, down regulation, or no change in the presence of H DNA motifs. Other mechanisms associated with the genomic expression of a genetic sequence in the presence of H DNA involves TFOs. In vitro studies have highlighted a decrease in gene expression in the presence of TFOs in mammalian cells. Another possible mechanism presented by Valentina et al. suggest the 13 mer AG motif oligonucleotide triplex complex (TFO complex) downregulates the transcription of mRNA through competitive inhibition. Direct inhibition of gene expression from H DNA is key to mutagenesis, replication inhibition, and even DNA recombination in the genome. Homologous recombination involving H DNA motifs have also been found in eukaryotes. RadA, a homologous protein to RecA, has been shown to have the same enzymatic activity in recombination as RecA. The protein has the ability to promote and exchange homologous strands through parallel triple stranded helices. The single stranded DNA (ssDNA) and complementary double stranded DNA (dsDNA) will form a D loop structure. Polypurine mirror repeat H DNA forming sequences were found neighboring the P1 promoter of the c MYC gene and are associated with the major breakpoint hotspots of this region. Cases of genetic instability were also observed in the F1 offspring of transgenic mice after incorporation of human H DNA forming sequences paired with Z DNA sequences into their genomes where no instability was previously reported. Additionally, formation of R. R. Y. H DNA conformations have been observed at the Mbr of the bcl 2 gene. Formation of these structures has been posited to cause the t(14;18) translocation observed in many cancers and most follicular lymphomas. This observation has led to research that indicated a substantial decrease in translocation events can be observed after blocking the formation of H DNA by altering the sequence of this region slightly. Long tracts of GAA·TTC have also been observed to form very stable H DNA structures. Interactions between these two H DNA structures, termed sticky DNA, has been shown to interrupt transcription of the X25, or frataxin gene. As decreased levels of the protein frataxin is associated with Friedreich's ataxia, formation of this instability has been suggested to be the basis for this genetic disease. Triple stranded DNA has been observed in supercoiled Satellite DNA in regions where microsatellite copy numbers are highly variable, along with inverted repeat Z DNA structures within a larger 2.1kb satellite DNA repeat unit. Additionally, H DNA has been shown to cause mutations related to critical cellular processes like DNA replication and transcription. Various nucleases have been shown to interact with H DNA in a replication dependent or replication independent manner. These enzymes cleave H DNA at the loop formed by the two Hoogsteen hydrogen bonded strands and the 5' end of the other Watson Crick hydrogen bonded strand, respectively. H DNA can be perceived as one of these lesions. A study observing transcription by T7 RNA polymerase on a stable H DNA forming sequence analog found transcription blockage at the duplex to triplex junction. Here, the template strand was the central strand of the H DNA, and the difficulty of disrupting its Watson Crick and Hoogsteen hydrogen bonds stopped transcription from progressing. When transcription by T7 was observed on the P0 promoter of the c MYC gene, the shortened transcription products that were found indicated that transcription was stopped in close proximity to the H DNA forming sequence downstream of the promoter. Formation of H DNA in this region prevents T7 from traveling down the template strand because of the steric hindrance it causes. This stops transcription and signals for TCR factors to come resolve the H DNA, which results in DNA excision that can cause genetic instability. This coupled with the activity of TCR factors during transcription makes it highly mutagenic, with it playing a role in the development of Burkitt lymphoma and leukemia. TFOs tethered to mutagens have also been shown to promote DNA damage and induce mutagenesis. One study on in vivo targeting of hematopoietic stem cells proposed a novel technique of conjugating PNA molecules with cell penetrating peptide (CPPs) alongside poly(lactic co glycolic acid) (PLGA) nanoparticles to enable 6 bp modifications in the CCR5 gene. The editing of the CCR5 gene has been linked to HIV 1 resistance. CPPs are proteins that are able to carry “cargo” such as small proteins or molecules successfully into cells. The PGLAs are biodegradable material that encapsulate PNA molecules as nanoparticles for site specific genome modifications. The F508 del mutation is the most commonly occurring mutation which leads a person to have CF. The F508 mutation leads to a loss of function of the CFTR, which is a plasma membrane chloride channel that is regulated by a cyclic adenosine monophosphate(cAMP). In this study, they were able to create the novel treatment approach for CF through the use of nanoparticles to correct the F508 del CFTR mutation both in vitro in human bronchial epithelial (HBE) cells and in vivo in a CF mouse model which resulted in the appearance of CFTR dependent chloride transport. as well as fellow scientist Fraser. However, Watson and Crick soon identified several problems with these models:
Negatively charged phosphates near the axis repel each other, leaving the question of how the three chain structure stays together. In a triple helix model (specifically Pauling and Corey's model), some of the van der Waals distances appear to be too small. Fraser's model differed from Pauling and Corey's in that in his model the phosphates are on the outside and the bases are on the inside, linked together by hydrogen bonds. However, Watson and Crick found Fraser's model to be too ill defined to comment specifically on its inadequacies. An alternative triple stranded DNA structure was described in 1957. Felsenfeld, Davies, and Rich predicted that if one strand contained only purines and the other strand only purines, the strand would undergo a conformational change to form a triple stranded DNA helix. The triple stranded DNA (H DNA) was predicted to be composed of one polypurine and two polypyrimidine strands. Additionally, it was soon found that homopyrimidine and some purine rich oligonucleotide are able form a stable H DNA structure with the homopurine homopyrimidine binding sequence specific structures on the DNA duplexes.