Екі фотондық люминесценциялық микроскопия

Кіріспе

Флуоресценттік бейнелеу техникасы

Екі фотондық қоздыру микроскопиясы (TPEF немесе 2PEF) – флуоресценттік бейнелеу техникасы, ол тірі тіндерді шамамен бір миллиметрге дейін қалыңдығы бойынша бейнелеуге ерекше қолайлы. Традициялық флуоресценттік микроскопиядан айырмашылығы, онда қоздыру толқынының ұзындығы шығарылатын толқынының ұзындығынан қысқа, екі фотондық қоздыру үшін екі фотонмен бірдей қоздыру қажет, олардың толқынының ұзындығы шығарылатын жарықтан ұзын. Лазер тіндің белгілі бір нүктесіне бағытталып, суретті кезең-кезеңімен алу үшін үлгі бойынша сканерленеді. Екі фотондық қоздырудың сызықтық еместігіне байланысты, негізінен лазерлік сәуленің микрометрлік фокусындағы флуорофорлар қоздырылады, бұл суреттің кеңістіктік ажыратымдылығын қамтамасыз етеді. Бұл конфокалды микроскопиядан өзгеше, онда кеңістіктік ажыратымдылық қоздыру фокусының өзара әрекеттесуімен және кішкентай тесік арқылы шектелген анықтамамен қамтамасыз етіледі. Екі фотондық қоздыру микроскопиясы әдетте инфрақызылға жақын (NIR) қоздыру жарығын пайдаланады, ол флуоресценттік бояуларды қоздыруға да мүмкіндік береді. Инфрақызыл жарықты қолдану тіндердегі шашырауды азайтады, себебі инфрақызыл жарық әдеттегі биологиялық тіндерде аз шашырайды. Көп фотондық сіңіруге байланысты фондық сигнал күшті түрде жойылады. Бұл екі фактор да осы техниканың ену тереңдігін арттырады. Екі фотондық қоздыру, терең тіндерге енуіне, жарықты тиімді анықтауына және фотоағартудың азаюына байланысты конфокалды микроскопияға артық балама болуы мүмкін.

Тұжырымдама

Екі фотондық қоздыру екі фотонды сіңіруді қолданады, бұл тұжырымды алғаш рет Мария Гёпперт Майер (1906–1972) 1931 жылы докторлық диссертациясында сипаттаған, ал 1961 жылы Вольфганг Кайзер лазерлік қоздыруды қолдана отырып CaF2:Eu2+ кристалдарында алғаш байқаған. 1962 жылы Исаак Абелла цезий буында бір атомды екі фотонмен қоздыру мүмкін екенін көрсетті. Екі фотондық қоздыру флуоресценциялық микроскопиясы лазерлік сканерлеу конфокалды микроскопиясы және Раман микроскопиясы сияқты басқа конфокалды лазерлік микроскопия әдістерімен ұқсас. Бұл әдістер кескіндерді жасау үшін растрлық үлгіде сканерленген фокусталған лазерлік сәулелерді пайдаланады және екеуі де оптикалық қима жасау эффектісіне ие. Конфокалды микроскоптардан айырмашылығы, көп фотонды микроскоптарда конфокалды микроскоптардың оптикалық қима жасау сапасын қамтамасыз ететін кіші тесіктер болмайды. Көп фотонды микроскоптар арқылы алынған оптикалық қима, қоздырудың нүктелік таралу функциясының нәтижесі болып табылады. Екі фотондық қоздыру тұжырымы, бір фотондық қоздыруға қажетті энергиядан салыстырмалы түрде төмен энергияға ие екі фотон да бір кванттық оқиғада флуорофорды қоздыра алады деген идеяға негізделген. Әр фотон молекуланы қоздыру үшін қажетті энергияның шамамен жартысын тасымалдайды. Шығарылатын фотон екі қоздырғыш фотонға қарағанда жоғары энергияға (қысқа толқын ұзындығына) ие. Екі фотонның дерлік бір уақытта сіңірілу ықтималдығы өте төмен. Сондықтан, әдетте, фемтосекундтық импульсті лазер арқылы туындайтын қоздыру фотондарының жоғары шыңы қажет. Мысалы, бірдей орташа лазерлік қуат, бірақ импульссіз, екі фотондық эффект арқылы импульстік лазер тудырған флуоресценциямен салыстырғанда байқалатын флуоресценцияға әкелмейді. Ұзын толқын ұзындығы, төмен энергиялы (әдетте инфрақызыл) қоздыру лазерлері тірі жасушаларды бейнелеу үшін өте қолайлы, себебі олар бір фотондық қоздыру үшін қолданылатын қысқа толқынды лазерлерге қарағанда аз зиян келтіреді, сондықтан тірі тіндерді аз уытты әсерлермен ұзақ уақыт бойы бақылауға болады. Ең көп қолданылатын флуорофорлар 400–500 нм диапазонында қоздыру спектрлеріне ие, ал екі фотондық флуоресценцияны қоздыру үшін қолданылатын лазер Ti сапфирлі лазерлер тудыратын ~700–1100 нм (инфрақызыл) диапазонында орналасқан. Егер флюорофор бір мезгілде екі инфрақызыл фотонды сіңіріп алса, ол қозған күйге көтерілу үшін жеткілікті энергияны сіңіреді. Флюорофор содан кейін қолданылған флюорофор түріне байланысты (әдетте көрінетін спектрде) толқын ұзындығы бар бір фотонды шығарады. Флюорофорды қоздыру кезінде екі фотон сіңіріледі, сондықтан флюорофордан флуоресценттік сәуле шығару ықтималдығы қоздыру қарқындылығымен квадраттық түрде артады. Сондықтан, лазерлік сәуле диффузияланғанға қарағанда тығыз шоғырланған жерде әлдеқайда көп екі фотондық флуоресценция туындайды. Іс жүзінде, қоздыру шағын фокустық көлемге (~1 фемтолитр) шектеледі, нәтижесінде фокустан тыс объектілерді жоғары деңгейде қабылдамау пайда болады. Қоздырудың осы локализациясы жалғыз фотондық микроскоптарға қарағанда маңызды артықшылық болып табылады, олар фокустан тыс флуоресценцияны қабылдамау үшін кіші тесіктер сияқты элементтерді қолдануы керек. Үлгіден шыққан флуоресценция содан кейін фотокөбейтуші түтік сияқты жоғары сезімтал детектормен жиналады. Бұл байқалатын жарық қарқындылығы соңғы кескіндегі бір пикселге айналады; кескіннің барлық пикселдерін құру үшін фокустық нүкте үлгідегі қажетті аймар бойынша сканерленеді.

Two photon excitation employs two photon absorption, a concept first described by Maria Goeppert Mayer (1906–1972) in her doctoral dissertation in 1931, and first observed in 1961 in a CaF2:Eu2+ crystal using laser excitation by Wolfgang Kaiser. Isaac Abella showed in 1962 in caesium vapor that two photon excitation of single atoms is possible. Two photon excitation fluorescence microscopy has similarities to other confocal laser microscopy techniques such as laser scanning confocal microscopy and Raman microscopy. These techniques use focused laser beams scanned in a raster pattern to generate images, and both have an optical sectioning effect. Unlike confocal microscopes, multiphoton microscopes do not contain pinhole apertures that give confocal microscopes their optical sectioning quality. The optical sectioning produced by multiphoton microscopes is a result of the point spread function of the excitation. The concept of two photon excitation is based on the idea that two photons, of comparably lower photon energy than needed for one photon excitation, can also excite a fluorophore in one quantum event. Each photon carries approximately half the energy necessary to excite the molecule. The emitted photon is at a higher energy (shorter wavelength) than either of the two exciting photons. The probability of the near simultaneous absorption of two photons is extremely low. Therefore, a high peak flux of excitation photons is typically required, usually generated by femtosecond pulsed laser. For example, the same average laser power but without pulsing results in no detectable fluorescence compared to fluorescence generated by the pulsed laser via the two photon effect. The longer wavelength, lower energy (typically infrared) excitation lasers of multiphoton microscopes are well suited to use in imaging live cells as they cause less damage than the short wavelength lasers typically used for single photon excitation, so living tissues may be observed for longer periods with fewer toxic effects. The most commonly used fluorophores have excitation spectra in the 400–500 nm range, whereas the laser used to excite the two photon fluorescence lies in the ~700–1100 nm (infrared) range produced by Ti sapphire lasers. If the fluorophore absorbs two infrared photons simultaneously, it will absorb enough energy to be raised into the excited state. The fluorophore will then emit a single photon with a wavelength that depends on the type of fluorophore used (typically in the visible spectrum). Because two photons are absorbed during the excitation of the fluorophore, the probability of fluorescent emission from the fluorophores increases quadratically with the excitation intensity. Therefore, much more two photon fluorescence is generated where the laser beam is tightly focused than where it is more diffuse. Effectively, excitation is restricted to the tiny focal volume (~1 femtoliter), resulting in a high degree of rejection of out of focus objects. This localization of excitation is the key advantage compared to single photon excitation microscopes, which need to employ elements such as pinholes to reject out of focus fluorescence. The fluorescence from the sample is then collected by a high sensitivity detector, such as a photomultiplier tube. This observed light intensity becomes one pixel in the eventual image; the focal point is scanned throughout a desired region of the sample to form all the pixels of the image.

Даму

Екі фотонды микроскопия 1990 жылы Корнелл университетінің Ватт В. Вебб зертханасында Винфрид Дэнк пен Джеймс Стриклер тарапынан жасалып, патенттелген. Олар екі фотонды сіңіру идеясын лазерлік сканердің қолданылуымен біріктірді. Екі фотонды қоздыру микроскопиясында инфрақызыл лазер сәулесі объектив линза арқылы шоғырландырылады. Көбінесе қолданылатын Ti сапфир лазерінің импульс ені шамамен 100 фемтосекунд (fs) және қайталану жиілігі шамамен 80 МГц болып келеді, бұл екі фотонды сіңіру үшін қажетті жоғары фотон тығыздығы мен ағынына мүмкіндік береді және толқын ұзындығының кең диапазонында реттеуге болады. Жарық шашырату тіндерінде флюорофорларды қоздыру үшін инфрақызыл сәулені пайдаланудың қосымша артықшылықтары бар. Ұзын толқын ұзындығы қысқа толқын ұзындығына қарағанда аз шашырайды, бұл жоғары ажыратымды бейнелеу үшін пайдалы. Сонымен қатар, бұл төмен энергиялы фотондар ошақтан тыс жерде зақымдануға себеп болу ықтималдығы аз. Конфокалды микроскоппен салыстырғанда, фотондық детекция әлдеқайда тиімді, себебі тіпті шашыраған фотондар да пайдалы сигналға үлес қосады. Шашырату тіндерінде бейнелеу үшін осы артықшылықтар екі фотондық қоздыру микроскопиясы ойлап табылғаннан кейін бірнеше жыл өткен соң ғана анықталды. Екі фотонды микроскопияны қолдануда ескеру қажет бірнеше мәселе бар: екі фотондық қоздыру үшін қажетті импульсті лазерлер конфокалды микроскопияда қолданылатын үздіксіз толқынды (CW) лазерлерге қарағанда әлдеқайда қымбат. Молекуланың екі фотонды сіңіру спектрі оның бір фотонды спектрінен айтарлықтай өзгеше болуы мүмкін. Жоғары ретті фотозақымдану проблема тудырады, ал ағарту лазерлік қуаттың квадратына пропорционалды, ал бір фотонды (конфокалды) жағдайда сызықтық. Оқшауланған жасушалар сияқты өте жұқа нысандар үшін бір фотонды (конфокалды) микроскоптар олардың қысқа қоздыру толқын ұзындығының арқасында жоғары оптикалық ажыратымдылыққа ие бейнелерді жасауға қабілетті. Алайда, шашырату тіндерінде екі фотонды микроскоптың оптикалық кесу және жарық детекциялау қабілеттері жақсы нәтижелер береді.

Негізгі

Екі фотондық микроскопия физиология, нейробиология, эмбриология және тіндік инженерия сияқты көптеген салаларда қолданылған. Осы техниканың арқасында тіпті жұқа, дерлік мөлдір тіндер (мысалы, тері жасушалары) да айқын егжей-тегжейлі бейнеленген. Екі фотондық микроскопияның жоғары жылдамдықты бейнелеу қабілеттерін инвазивті емес оптикалық биопсияда да пайдалануға болады. Екі фотондық микроскопия локальды химиялық реакцияларды тудыру үшін тиімді қолданылды, бұл реакциялар әдетте бірдей ауысу диполь моментінен туындайды деп есептеледі. Дегенерациясыз екі фотондық қозу, яғни әртүрлі толқын ұзындығы бар 2 фотонды пайдалану, барлық сынақтан өткен кішкентай молекулалар мен флуоресцентті ақуыздардың флуоресценциясын арттыратыны көрсетілді.

Қатерлі ісік зерттеулері

2PEF тері қатерлі ісігін сипаттауда да өте құнды екені дәлелденді. Бұрыннан белгілі болғандай, ол ісік жасушаларының тоқтауын, ісік жасушаларының тромбоциттермен әрекеттесуін, ісік жасушаларының лейкоциттермен әрекеттесуін және метастаздық отарлану процестерін анықтауға мүмкіндік береді.

Эмбриондар зерттеулері

2PEF сүтқоректілердің эмбриондарының тірі жасушаларын ұзақ мерзімді бейнелеуде конфокалды микроскопия сияқты басқа техникалардан артықшылықтарын көрсетті.

Бүйрек зерттеулері

2PEF сонымен қатар, қол жеткізу қиын жасуша түрлерін, әсіресе бүйрек жасушаларын көрнекілеуде қолданылды. Ол сұйық динамикасы мен сүзілу процесін жақсырақ түсінуге көмектесті.

Нейробиологиялық ғылым

2PEF және осы әдістің 3PEF-ке кеңейтілуі тірі және тіпті қозғалыстағы жануарлардың миындағы бұзылмаған жүйке тіндерін сипаттау үшін қолданылады. Атап айтқанда, бұл әдіс нейронның немесе нейрон популяциясының кальцийлік бейнелеуіне, фотофармакологияға, оның ішінде глутамат сияқты компоненттерді жергілікті босатуға немесе фотосвиткалы препараттардың изомеризациясына, сондай-ақ нейротрансмиттерлердің концентрациясын көрсететін басқа да генетикалық кодталған сенсорларды бейнелеуге ыңғайлы. Қазіргі уақытта екі фотондық микроскопия жеміс шыбындары (Drosophila melanogaster), егеуқұйрықтар, әнші құстар, приматтар, мысықтар, тышқандар (Mus musculus) және зебра балықтары сияқты модельді организмдерде нейрондардың тірі қызметін бейнелеу үшін кеңінен қолданылады. Микроскоп пен сканерлеу құрылғыларының үлкендігіне байланысты жануарлар көбінесе бастары бекітіліп зерттеледі, бірақ қозғалатын және еркін мінез-құлық көрсететін жануарларда нейрондарды бейнелеуге мүмкіндік беретін кішірейтілген микроскоптар да жасалып жатыр.

Жоғары деңгейдегі қозу

Үш немесе одан көп фотонның бірдей сіңірілуі де мүмкін, бұл жоғары ретті мультифотондық қоздыру микроскопиясына жол береді. "Үш фотонды қоздыру флуоресценциялық микроскопиясы" (3PEF) деп аталатын әдіс, 2PEF-тен кейін ең көп қолданылатын техника болып табылады және оны толықтырады. Үш фотонды қоздыруды пайдаланып, тірі организмде фотосүйгіш препараттардың локальді изомерленуі туралы да хабарланған.

Екі фотоны қоздыру микроскопиясы үшін бояулар мен флуоресцентті ақуыздар

Жалпы, барлық көп қолданылатын флуоресцентті ақуыздар (CFP, GFP, YFP, RFP) және бояуларды екі фотондық режимде оятуға болады. Екі фотондық ояту спектрлері көбінесе айтарлықтай кеңейтілген, бұл флюорофорларды ояту толқын ұзындығын өзгерту арқылы таңдап оятуды қиындатады. Өте жоғары 2 фотондық сіңіру қимасы бар бірнеше жасыл, қызыл және NIR сәуле шығаратын бояулар (пробтар және реактивті белгілер) туралы хабарламалар жарияланған. СеТау 647 және СеТау 665, жаңа типтегі скварaйн ротаксен, жақын ИК аймағында 10,000 GM-ге дейін жететін өте жоғары екі фотондық әрекет қимасын көрсетеді, бұл көрсеткіш басқа органикалық бояулар класымен салыстыруға келмейді.