Двухфотонная возбуждающая флуоресцентная микроскопия

Введение

Флуоресцентная методика визуализации

Двухфотонная возбудительная микроскопия (TPEF или 2PEF) – это флуоресцентная методика визуализации, особенно хорошо подходящая для получения изображений рассеивающих живых тканей толщиной до одного миллиметра. В отличие от традиционной флуоресцентной микроскопии, где длина волны возбуждения короче длины волны излучения, двухфотонное возбуждение требует одновременного возбуждения двумя фотонами с длиной волны, превышающей длину волны излучаемого света. Лазер фокусируется на определенной точке в ткани и сканирует образец для последовательного построения изображения. Благодаря нелинейности двухфотонного возбуждения, возбуждаются преимущественно флюорофоры в микрометровом фокусе лазерного луча, что определяет пространственное разрешение изображения. Это отличается от конфокальной микроскопии, где пространственное разрешение достигается за счет взаимодействия фокуса возбуждения и ограниченной апертуры детектора. Двухфотонная возбудительная микроскопия обычно использует возбуждение в ближнем инфракрасном (НИК) диапазоне, которое также способно возбуждать флуоресцентные красители. Использование инфракрасного света минимизирует рассеяние в ткани, поскольку инфракрасный свет меньше рассеивается в типичных биологических тканях. Благодаря многофотонному поглощению, фоновый сигнал значительно подавляется. Оба этих эффекта приводят к увеличению глубины проникновения данной методики. Двухфотонное возбуждение может быть превосходящей альтернативой конфокальной микроскопии благодаря большей глубине проникновения в ткань, эффективному детектированию света и снижению фотовыцветания.

Концепция

Двухфотонное возбуждение использует двухфотонное поглощение, концепция, впервые описанная Марией Гёпперт-Майер (1906–1972) в своей докторской диссертации в 1931 году и впервые наблюдаемая в 1961 году в кристалле CaF2:Eu2+ с использованием лазерного возбуждения, осуществленного Вольфгангом Кайзером. Исаак Абелла в 1962 году показал, что двухфотонное возбуждение отдельных атомов возможно в парах цезия. Флуоресцентная микроскопия с двухфотонным возбуждением имеет сходство с другими методами конфокальной лазерной микроскопии, такими как лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и рамановская микроскопия. Эти методы используют сфокусированные лазерные лучи, сканируемые по растровой схеме для создания изображений, и оба обладают эффектом оптического сечения. В отличие от конфокальных микроскопов, мультифотонные микроскопы не содержат апертурных диафрагм, обеспечивающих оптическое сечение в конфокальных микроскопах. Оптическое сечение, получаемое с помощью мультифотонных микроскопов, является результатом функции рассеяния точки возбуждения. Концепция двухфотонного возбуждения основана на идее, что два фотона, каждый из которых имеет сравнительно меньшую энергию, чем требуется для однофотонного возбуждения, также могут возбудить флюорофор в одном квантовом событии. Каждый фотон несет приблизительно половину энергии, необходимой для возбуждения молекулы. Излучаемый фотон имеет более высокую энергию (более короткую длину волны), чем любой из двух возбуждающих фотонов. Вероятность почти одновременного поглощения двух фотонов чрезвычайно мала. Поэтому обычно требуется высокий пиковый поток фотонов возбуждения, как правило, генерируемый фемтосекундным импульсным лазером. Например, та же средняя мощность лазера, но без импульсов, не приводит к обнаружимой флуоресценции по сравнению с флуоресценцией, генерируемой импульсным лазером посредством двухфотонного эффекта. Лазеры с большей длиной волны и меньшей энергией (обычно инфракрасные), используемые в мультифотонных микроскопах, хорошо подходят для визуализации живых клеток, поскольку они вызывают меньше повреждений, чем лазеры с короткой длиной волны, обычно используемые для однофотонного возбуждения, что позволяет наблюдать за живыми тканями в течение более длительного времени с меньшим количеством токсических эффектов. Наиболее часто используемые флюорофоры имеют спектры возбуждения в диапазоне 400–500 нм, в то время как лазер, используемый для возбуждения двухфотонной флуоресценции, находится в диапазоне ~700–1100 нм (инфракрасный), генерируемом Ti:сапфировыми лазерами. Если флюорофор поглощает два инфракрасных фотона одновременно, он поглотит достаточно энергии, чтобы перейти в возбужденное состояние. Затем флюорофор излучит один фотон с длиной волны, которая зависит от типа используемого флюорофора (обычно в видимом спектре). Поскольку два фотона поглощаются во время возбуждения флюорофора, вероятность флуоресцентного излучения от флюорофоров увеличивается квадратично с интенсивностью возбуждения. Следовательно, гораздо больше двухфотонной флуоресценции генерируется там, где лазерный луч плотно сфокусирован, чем там, где он более рассеян. Фактически, возбуждение ограничено крошечным фокусным объемом (~1 фемтолитр), что приводит к высокой степени отторжения объектов, находящихся вне фокуса. Эта локализация возбуждения является ключевым преимуществом по сравнению с микроскопами с однофотонным возбуждением, которым необходимо использовать такие элементы, как апертурные диафрагмы, для отторжения внефокусной флуоресценции. Флуоресценция от образца затем собирается высокочувствительным детектором, таким как фотоэлектронный умножитель. Эта наблюдаемая интенсивность света становится одним пикселем в конечном изображении; фокусная точка сканируется по всей желаемой области образца для формирования всех пикселей изображения.

Two photon excitation employs two photon absorption, a concept first described by Maria Goeppert Mayer (1906–1972) in her doctoral dissertation in 1931, and first observed in 1961 in a CaF2:Eu2+ crystal using laser excitation by Wolfgang Kaiser. Isaac Abella showed in 1962 in caesium vapor that two photon excitation of single atoms is possible. Two photon excitation fluorescence microscopy has similarities to other confocal laser microscopy techniques such as laser scanning confocal microscopy and Raman microscopy. These techniques use focused laser beams scanned in a raster pattern to generate images, and both have an optical sectioning effect. Unlike confocal microscopes, multiphoton microscopes do not contain pinhole apertures that give confocal microscopes their optical sectioning quality. The optical sectioning produced by multiphoton microscopes is a result of the point spread function of the excitation. The concept of two photon excitation is based on the idea that two photons, of comparably lower photon energy than needed for one photon excitation, can also excite a fluorophore in one quantum event. Each photon carries approximately half the energy necessary to excite the molecule. The emitted photon is at a higher energy (shorter wavelength) than either of the two exciting photons. The probability of the near simultaneous absorption of two photons is extremely low. Therefore, a high peak flux of excitation photons is typically required, usually generated by femtosecond pulsed laser. For example, the same average laser power but without pulsing results in no detectable fluorescence compared to fluorescence generated by the pulsed laser via the two photon effect. The longer wavelength, lower energy (typically infrared) excitation lasers of multiphoton microscopes are well suited to use in imaging live cells as they cause less damage than the short wavelength lasers typically used for single photon excitation, so living tissues may be observed for longer periods with fewer toxic effects. The most commonly used fluorophores have excitation spectra in the 400–500 nm range, whereas the laser used to excite the two photon fluorescence lies in the ~700–1100 nm (infrared) range produced by Ti sapphire lasers. If the fluorophore absorbs two infrared photons simultaneously, it will absorb enough energy to be raised into the excited state. The fluorophore will then emit a single photon with a wavelength that depends on the type of fluorophore used (typically in the visible spectrum). Because two photons are absorbed during the excitation of the fluorophore, the probability of fluorescent emission from the fluorophores increases quadratically with the excitation intensity. Therefore, much more two photon fluorescence is generated where the laser beam is tightly focused than where it is more diffuse. Effectively, excitation is restricted to the tiny focal volume (~1 femtoliter), resulting in a high degree of rejection of out of focus objects. This localization of excitation is the key advantage compared to single photon excitation microscopes, which need to employ elements such as pinholes to reject out of focus fluorescence. The fluorescence from the sample is then collected by a high sensitivity detector, such as a photomultiplier tube. This observed light intensity becomes one pixel in the eventual image; the focal point is scanned throughout a desired region of the sample to form all the pixels of the image.

Разработка

Двухфотонная микроскопия была разработана и запатентована Винфридом Дэнком и Джеймсом Стриклером в лаборатории Уотта У. Уэбба в Корнелльском университете в 1990 году. Они объединили принцип поглощения двух фотонов с использованием лазерного сканера. В двухфотонной возбуждающей микроскопии инфракрасный лазерный луч фокусируется через объектив. Обычно используемый титан-сапфировый лазер имеет ширину импульса около 100 фемтосекунд (fs) и частоту повторения около 80 МГц, что обеспечивает высокую плотность и поток фотонов, необходимые для поглощения двух фотонов, и может быть настроен в широком диапазоне длин волн. Использование инфракрасного света для возбуждения флюорофоров в тканях, рассеивающих свет, имеет дополнительные преимущества. Более длинные волны рассеиваются в меньшей степени, чем короткие, что полезно для получения изображений с высоким разрешением. Кроме того, эти фотоны с более низкой энергией реже вызывают повреждения за пределами фокального объема. По сравнению с конфокальным микроскопом, детектирование фотонов гораздо эффективнее, поскольку даже рассеянные фотоны вносят вклад в полезный сигнал. Эти преимущества при визуализации в рассеивающих тканях были признаны лишь спустя несколько лет после изобретения двухфотонной возбуждающей микроскопии. Существуют определенные ограничения при использовании двухфотонной микроскопии: импульсные лазеры, необходимые для двухфотонного возбуждения, значительно дороже, чем лазеры непрерывного излучения (CW), используемые в конфокальной микроскопии. Спектр поглощения двух фотонов молекулы может существенно отличаться от ее спектра поглощения одного фотона. Фотоповреждение высшего порядка становится проблемой, а выцветание масштабируется с квадратом мощности лазера, в то время как для однофотонного (конфокального) микроскопа оно линейно. Для очень тонких объектов, таких как изолированные клетки, однофотонные (конфокальные) микроскопы могут создавать изображения с более высоким оптическим разрешением благодаря своим более коротким длинам волн возбуждения. Однако в рассеивающих тканях превосходные возможности оптического секционирования и детектирования света двухфотонного микроскопа обеспечивают лучшую производительность.

Основной

Двухфотонная микроскопия нашла применение в многочисленных областях, включая физиологию, нейробиологию, эмбриологию и тканевую инженерию. Благодаря этой технике удалось визуализировать даже тонкие, почти прозрачные ткани (например, клетки кожи) с высокой степенью детализации. Высокоскоростные возможности визуализации двухфотонной микроскопии также могут быть использованы для неинвазивной оптической биопсии. Двухфотонная микроскопия успешно применяется для инициирования локализованных химических реакций, которые обычно требуют одного и того же дипольного момента для возникновения. Недегенеративное двухфотонное возбуждение, или использование двух фотонов с разными длинами волн, показало способность увеличивать флуоресценцию всех протестированных малых молекул и флуоресцентных белков.

Исследования рака

2PEF также доказал свою высокую эффективность в характеристике рака кожи. Было также показано, что он позволяет выявлять остановку опухолевых клеток, взаимодействие опухолевых клеток с тромбоцитами, взаимодействие опухолевых клеток с лейкоцитами и процессы метастатического колонизирования.

Эмбриональные исследования

2PEF продемонстрировал преимущества по сравнению с другими методами, такими как конфокальная микроскопия, при длительной визуализации живых клеток эмбрионов млекопитающих.

Исследования почки

2PEF также использовался для визуализации труднодоступных типов клеток, особенно клеток почек. Его применение позволило лучше понять гидродинамику и процессы фильтрации.

Нейробиологии

2PEF, а также расширение этого метода до 3PEF используются для характеристики неповрежденных нервных тканей мозга живых и даже активно ведущих себя животных. В частности, метод эффективен для кальциевой визуализации отдельных нейронов или их популяций, для фотофармакологии, включая локализованное высвобождение таких компонентов, как глутамат, или изомеризацию фотопереключаемых препаратов, а также для визуализации других генетически закодированных сенсоров, регистрирующих концентрацию нейротрансмиттеров. В настоящее время двухфотонная микроскопия широко применяется для визуализации активности нейронов в модельных организмах, таких как плодовые мушки (Drosophila melanogaster), крысы, певчие птицы, приматы, хорьки, мыши (Mus musculus) и данио рерио (zebrafish). Обычно животных фиксируют головой из-за габаритов микроскопа и сканирующих устройств, однако разрабатываются и миниатюрные микроскопы, позволяющие визуализировать нейроны у движущихся и свободно ведущих себя животных.

Возбуждение высшего порядка

Одновременное поглощение трех или более фотонов также возможно, что позволяет реализовать микроскопию возбуждения многофотонного поглощения более высокого порядка. Так называемая "флуоресцентная микроскопия с возбуждением тремя фотонами" (3PEF) является наиболее распространенной техникой после 2PEF, дополняя ее. Также сообщалось о локализованной изомеризации фотопереключаемых лекарственных препаратов *in vivo* с использованием возбуждения тремя фотонами.

Красители и флуоресцентные белки для двухфотонной возбудительной микроскопии

В целом, все широко используемые флуоресцентные белки (CFP, GFP, YFP, RFP) и красители могут возбуждаться в двухфотонном режиме. Спектры двухфотонного возбуждения часто значительно шире, что затрудняет селективное возбуждение флюорофоров путем изменения длин волн возбуждения. Сообщалось о нескольких зеленых, красных и излучающих в ближней ИК области красителях (зондах и реактивных метках) с исключительно высокими двухфотонными сечениями поглощения. SeTau 647 и SeTau 665, новый тип скворайнового ротаксана, демонстрируют исключительно высокие эффективные двухфотонные сечения, достигающие 10 000 GM в ближней ИК области, что превосходит показатели любого другого класса органических красителей.