Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
TILLING (Геномдардағы мақсатты жергілікті зақымдануларды анықтау) – молекулалық биологиядағы белгілі бір гендегі мутацияларды бағытталған түрде анықтауға мүмкіндік беретін әдіс. TILLING 2000 жылы Arabidopsis thaliana үлгілі өсімдігін пайдаланып енгізілді және Лука Комаиді қоса алған ғалымдар тобы оны басқа да қолданыстар мен әдістемелерге дамытты. Осы уақыттан бері TILLING зебра балығы, жүгері, бидай, күріш, соя, помидор және салат сияқты басқа да организмдерде кері генетика әдісі ретінде қолданылып келеді.
TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) is a method in molecular biology that allows directed identification of mutations in a specific gene. TILLING was introduced in 2000, using the model plant Arabidopsis thaliana, and expanded on into other uses and methodologies by a small group of scientists including Luca Comai. TILLING has since been used as a reverse genetics method in other organisms such as zebrafish, maize, wheat, rice, soybean, tomato and lettuce.
Шолу
Бұл әдіс стандартты және тиімді мутациялау техникасын, мысалы, этилметансульфонат (EMS) сияқты химиялық мутагенді пайдалануды, мақсатты гендегі бір негіздік мутацияны (осыны нүктелік мутация деп те атайды) анықтайтын сезімтал ДНК скринингімен үйлестіреді. TILLING әдісі ПТР арқылы күшейтілген көптеген аллельдерде пайда болатын және содан кейін қыздырылып, баяу салқындатылатын ДНК гетеродуплекстерінің қалыптасуына негізделген. Екі ДНК тізбегінің сәйкес келмейтін жерінде "көпіршік" пайда болады, ол бір тізбекті нуклеазамен кесіледі. Содан кейін өнімдер әртүрлі платформаларда мөлшері бойынша бөлінеді (төменде қараңыз). Сәйкессіздіктер туындаған мутацияға, жеке организмдегі гетерозиготтыққа немесе жеке организмдер арасындағы табиғи айырмашылықтарға байланысты болуы мүмкін. EcoTILLING – бұл EcoTILLING техникаларын жеке организмдердегі табиғи мутацияларды іздеу үшін, әдетте популяциялық генетикалық талдау үшін қолданатын әдіс. DEcoTILLING – бұл TILLING және EcoTILLING-тің модификациясы, ол фрагменттерді анықтау үшін қолжетімді әдісті пайдаланады. Жаңа буынды секвенирлеу (NGS) технологияларының пайда болуымен, көп өлшемді жинақталған үлгілерден күшейтілген мақсатты гендердің Illumina секвенирлеуіне негізделген секвенирлеу арқылы TILLING әзірленді, бұл мүмкін болатын бір нуклеотидтік өзгерістерді анықтауға мүмкіндік береді.
The method combines a standard and efficient technique of mutagenesis using a chemical mutagen such as ethyl methanesulfonate (EMS) with a sensitive DNA screening technique that identifies single base mutations (also called point mutations) in a target gene. The TILLING method relies on the formation of DNA heteroduplexes that are formed when multiple alleles are amplified by PCR and are then heated and slowly cooled. A “bubble” forms at the mismatch of the two DNA strands, which is then cleaved by a single stranded nuclease. The products are then separated by size on several different platforms (see below). Mismatches may be due to induced mutation, heterozygosity within an individual, or natural variation between individuals. EcoTILLING is a method that uses TILLING techniques to look for natural mutations in individuals, usually for population genetics analysis. DEcoTILLING is a modification of TILLING and EcoTILLING which uses an inexpensive method to identify fragments. Since the advent of NGS sequencing technologies, TILLING by sequencing has been developed based on Illumina sequencing of target genes amplified from multidimensionally pooled templates to identify possible single nucleotide changes.
Бір жіпті бөлінуіш ферменттер
Бір жіпті нуклеазалардың бірнеше көзі бар. Алғаш кеңінен қолданылған фермент – мунг бобы нуклеазасы болды, бірақ бұл нуклеазаның жоғары спецификалық емес активтілігі бар екені және тек төмен pH-та жұмыс істейтіндігі анықталды, бұл ПТР өнімдері мен бояумен белгіленген праймерлерді бұзуы мүмкін. Бір жіпті нуклеазаның бастапқы көзі CEL1 немесе CJE (селерей шырыны экстракты) болды, бірақ нарыққа басқа да өнімдер енді, оның ішінде Frontier Genomics SNiPerase ферменттері, олар белгіленген және белгіленбеген ПТР өнімдерін пайдаланатын платформаларда қолдану үшін оңтайландырылған (келесі бөлімді қараңыз). Transgenomic компания бір жіпті нуклеаза протеинін оқшаулап, оны рекомбинантты түрінде сатады. Рекомбинантты түрдің артықшылығы – фермент қоспаларынан айырмашылығы, ол ПТР праймерлеріндегі бояуларды ыдырататын спецификалық емес нуклеаза активтілігін қамтымайды. Оның кемшілігі – бағасы айтарлықтай жоғары.
There are several sources for single strand nucleases. The first widely used enzyme was mung bean nuclease, but this nuclease has been shown to have high non specific activity, and only works at low pH, which can degrade PCR products and dye labeled primers. The original source for single strand nuclease was from CEL1, or CJE (celery juice extract), but other products have entered the market including Frontier Genomics’ SNiPerase enzymes, which have been optimized for use on platforms that use labeled and unlabeled PCR products (see next section). Transgenomic isolated the single strand nuclease protein and sells it as a recombinant form. The advantage of the recombinant form is that unlike the enzyme mixtures, it does not contain non specific nuclease activity, which can degrade the dyes on the PCR primers. The disadvantage is a substantially higher cost.
Бөлінген өнімдерді бөлу
TILLING-ті сипаттаған алғашқы мақалада мутацияларды анықтау үшін HPLC қолданылды (McCallum және басқалар, 2000a). Бұл әдісті рестрикциялық фермент Cel I-ді LICOR гельді жүйесімен біріктіріп, мутацияларды анықтау үшін қолдану арқылы жоғары өнімділікке жетті (Colbert et al., 2001). Бұл жүйені қолданудың артықшылығы – мутациялық орындарды оңай растап, қате сигналдардан ажыратуға болады. Бұл алдыңғы және артқы праймерлер үшін әртүрлі түсті бояуларды қолдануға мүмкіндік береді. Бөліну өнімдері гельге жүгіргеннен кейін, оларды жеке арналарда қарастыруға болады, және RFLP сияқты, әр арнадағы жолақтың ішіндегі фрагменттердің мөлшері өнімнің толық мөлшеріне тең болуы керек. LICOR жүйесінің артықшылықтары: үлкен фрагменттерді (~ 2kb) бөлу, жоғары үлгі өткізу қабілеті (96 үлгі қағаз тарақтарға жүктеледі) және мутацияларды анықтауға арналған тегін бағдарлама (GelBuddy). LICOR жүйесінің кемшіліктері – плиталық гельдерді құю және ұзақ уақыт (~ 4 сағат) талап етілуі. TILLING және EcoTILLING әдістері қазір Advanced Analytical Technologies, ABI және Beckman компанияларының капиллярлық жүйелерінде қолданылады. Түспен белгіленбеген ПТР өнімдерін бөлу үшін бірнеше жүйелерді пайдалануға болады. Қарапайым агар электрофорезі жүйелері бөлінген өнімдерді арзанға және стандартты зертханалық жабдықпен бөліп алады. Бұл chum salmon-да SNP-лерді табу үшін қолданылды және DEcoTILLING деп аталды. Бұл жүйенің кемшілігі – полиакриламид жүйелерімен салыстырғанда төмен ажыратымдылық. Elchrom Scientific алдын ала құйылған, жоғары өнімді және стандартты полиакриламид гельдерінен гөрі сезімтал Spreadex гельдерін сатады. Advanced Analytical Technologies Inc компаниясы AdvanCE FS96 dsDNA флуоресценттік жүйесін сатады, бұл 96 капиллярлық электрофорез жүйесі, ол дәстүрлі әдістерге қарағанда бірнеше артықшылықтарға ие; оның ішінде үлкен фрагменттерді (40 кб-ға дейін) бөлу мүмкіндігі, тұзсыздандыру немесе тұндыру қадамы қажет емес, қысқа уақыт (~ 30 минут), 5 пг/мкл сезімталдық және флуоресцентті таңбаланған праймерлердің қажеті жоқ.
The first paper describing TILLING used HPLC to identify mutations (McCallum et al., 2000a). The method was made more high throughput by using the restriction enzyme Cel I combined with the LICOR gel based system to identify mutations (Colbert et al.,2001). Advantages to using this system are that mutation sites can be easily confirmed and differentiated from noise. This is because different colored dyes can be used for the forward and reverse primers. Once the cleavage products have been run on a gel, it can be viewed in separate channels, and much like an RFLP, the fragment sizes within a lane in each channel should add up to the full length product size. Advantages to the LICOR system are separation of large fragments (~ 2kb), high sample throughput (96 samples loaded on paper combs), and freeware to identify the mutations (GelBuddy). Drawbacks to the LICOR system is having to pour slab gels and long run times (~4 hours). TILLING and EcoTILLING methods are now being used on capillary systems from, Advanced Analytical Technologies, ABI and Beckman. Several systems can be used to separate PCR products that are not labeled with dyes. Simple agarose electrophoresis systems will separate cleavage products inexpensively and with standard lab equipment. This was used to discover SNPs in chum salmon and was referred to as DEcoTILLING. The disadvantage of this system is reduced resolution compared to polyacrylamide systems. Elchrom Scientific sells Spreadex gels which are precast, can be high throughput and are more sensitive than standard polyacrylamide gels. Advanced Analytical Technologies Inc sells the AdvanCE FS96 dsDNA Fluorescent System which is a 96 capillary electrophoresis system that has several advantages over traditional methods; including ability to separate large fragments (up to 40kb), no desalting or precipitation step required, short run times (~30 minutes), sensitivity to 5pg/ul and no need for fluorescent labeled primers.