Протеиндеді бөлу және сипаттаудың биохимиялық әдістері

Кіріспе

Белоктарды бөлудің және сипаттаудың биохимиялық әдістері

Иммуноэлектрофорез – электрофорез және антиденелермен реакцияға негізделген белоктарды бөлу мен сипаттаудың бірнеше биохимиялық әдістерінің жалпы атауы. Иммуноэлектрофорездің барлық түрлерінде иммуноглобулиндер, яғни антиденелер деп те аталатындар, бөлінетін немесе сипатталатын белоктармен әрекеттеседі. Бұл әдістер 20-шы ғасырдың екінші жартысында кеңінен қолданылған. Шамамен хронологиялық ретпен: Иммуноэлектрофоретикалық талдау (бір өлшемді иммуноэлектрофорез Grabar бойынша), қиылысқан иммуноэлектрофорез (екі өлшемді сандық иммуноэлектрофорез Clarke және Freeman бойынша немесе Laurell бойынша), зымыран тәрізді иммуноэлектрофорез (бір өлшемді сандық иммуноэлектрофорез Laurell бойынша), біріктірілген зымыран тәрізді иммуноэлектрофорез Svendsen және Harboe бойынша, аффиниттік иммуноэлектрофорез Bøg Hansen бойынша.

Әдістер

Иммуноэлектрофорез – электрофорез және антиденелердің реакциясы принциптерінің көптеген комбинацияларын сипаттайтын жалпы термин, ол иммунодиффузия деп те аталады. Электрофорез және антиденелермен реакция үшін дәстүрлі түрде жоғары pH-де (шамамен 8.6) буферленген, шамамен 1 мм қалыңдықтағы 1% агароза гельдері қолданылады. Агароза гель матрицасы ретінде таңдалды, себебі оның үлкен тесіктері бар, ол ақуыздардың еркін өтуіне және бөлінуіне мүмкіндік береді, бірақ ақуыздар мен спецификалық антиденелердің иммунопреципитаттарына тіреу қамтамасыз етеді. Жоғары pH таңдалды, өйткені антиденелер жоғары pH-де іс жүзінде қозғалмайды. Электрофорезге көлденең салқындату пластинасы бар құрылғыны пайдалану ұсынылады. Иммунопреципитаттар ылғал агароза гельінде көрінеді, бірақ құрғақ гельде Кумасси бриллиант көгі сияқты ақуыздық бояулармен боялады. SDS-гельдік электрофорезден айырмашылығы, агарозадағы электрофорез зерттелетін ақуыздардың табиғи құрылымын және белсенділігін сақтай отырып, табиғи жағдайларда жүзеге асырылады, сондықтан иммуноэлектрофорез ферменттік белсенділіктерді және лигандтармен байланысуды электрофоретикалық бөлінуден басқа сипаттауға мүмкіндік береді. Контриммуноэлектрофорез – иммунодиффузия мен электрофорездің үйлесімі. Электрофорез реакциядағы заттарды бір-біріне жылдам жылжыту процесін жеделдетеді. Grabar әдісімен иммуноэлектрофоретикалық талдау – иммуноэлектрофорездің классикалық әдісі. Ақуыздар электрофорез арқылы бөлінеді, содан кейін антиденелер бөлінген ақуыздардың жанындағы ойысқа салынады және бөлінген ақуыздар мен антиденелердің бір-біріне таралуынан кейін иммунопреципитаттар түзіледі. Иммуноэлектрофоретикалық талдаудың енгізілуі ақуыз химиясына үлкен серпін берді, алғашқы нәтижелердің бірі биологиялық сұйықтықтар мен биологиялық экстракттардағы ақуыздарды ажырату болды. Маңызды байқаулардың арасында сарысудағы әртүрлі ақуыздардың көптігі, иммуноглобулиндердің бірнеше кластарының болуы және олардың электрофоретикалық әртүрлілігі болды. Кросс-иммуноэлектрофорез екі өлшемді сандық иммуноэлектрофорез деп те аталады, Clarke және Freeman немесе Laurell әдісімен. Бұл әдісте ақуыздар бірінші өлшемдегі электрофорез кезінде бөлінеді, содан кейін антиденелерге қарай таратудың орнына, ақуыздар екінші өлшемде антиденесі бар гельге электрофорезбен бөлінеді. Иммунопреципитация екінші өлшемдегі электрофорез кезінде жүзеге асырылады және иммунопреципитаттардың ерекше қоңырау тәрізді пішіні болады, әрбір тұнба бір антигенді көрсетеді, тұнбаның орны ақуыз мөлшеріне, сондай-ақ гельдегі спецификалық антидене мөлшеріне байланысты, сондықтан салыстырмалы сандық өлшеу жүзеге асырылуы мүмкін. Кросс-иммуноэлектрофорездің сезімталдығы және ажыратымдылығы классикалық иммуноэлектрофоретикалық талдаудан жоғары, және әр түрлі мақсаттар үшін пайдалы әдістің бірнеше нұсқалары бар. Кросс-иммуноэлектрофорез биологиялық сұйықтықтардағы, әсіресе адам сарысуындағы және биологиялық экстракттардағы ақуыздарды зерттеу үшін қолданылған. Ракеталық иммуноэлектрофорез – бір өлшемді сандық иммуноэлектрофорез. Бұл әдіс автоматтандырылған әдістер пайда болғанға дейін адам сарысуындағы ақуыздарды сандық анықтау үшін қолданылған. Біріктірілген ракеталық иммуноэлектрофорез – бір өлшемді сандық иммуноэлектрофорездің модификациясы, ол ақуыздарды бөлу эксперименттерінен алынған фракциялардағы ақуыздарды егжей-тегжейлі өлшеу үшін қолданылады. Аффиниттік иммуноэлектрофорез – басқа макромолекулалар немесе лигандтармен спецификалық өзара әрекеттесу немесе кешенді түзілу арқылы ақуыздардың электрофоретикалық үлгісіндегі өзгерістерге негізделген. Аффиниттік иммуноэлектрофорез, мысалы, лектиндермен немесе гликан құрамы немесе лигандтармен байланысу сияқты ерекшеліктері бар ақуыздарды сипаттау үшін, байланысу константаларын бағалау үшін қолданылды. Аффиниттік иммуноэлектрофорездің кейбір нұсқалары иммобилизацияланған лигандтарды пайдалану арқылы аффиниттік хроматографияға ұқсас. Лигандтардың байланысуы. Агароза гельіндегі иммунопреципитаттың ашық құрылымы радиоактивті белгіленген антиденелер мен басқа лигандтардың қосымша байланысуына мүмкіндік береді, осылайша спецификалық ақуыздарды анықтауға болады. Бұл мүмкіндікті қолдану, мысалы, иммуноглобулин Е (IgE) реакциясы арқылы аллергендерді анықтау және лектиндермен гликопротеиндерді анықтау үшін қолданылды. Жалпы түсініктемелер. Екі фактор иммуноэлектрофоретикалық әдістердің кеңінен қолданылмауына себеп болады. Біріншіден, олар еңбекке талапты және кейбір қолмен орындау біліктілігін қажет етеді. Екіншіден, оларға көп мөлшердегі поликлоналды антиденелер қажет. Бүгінде гельдік электрофорездік талдаудан кейін электрофлоттинг ақуыз сипаттамасы үшін артық таңдалады, өйткені оның оңайлығы, жоғары сезімталдығы және спецификалық антиденелерге азырақ талап қоюы. Сонымен қатар, ақуыздар гельдік электрофорез арқылы олардың көрінетін молекулалық салмағы бойынша бөлінеді, бұл иммуноэлектрофорезбен мүмкін емес, бірақ бұл ретте иммуноэлектрофоретикалық әдістер қажет болғанда, азайту жағдайларында да пайдалы болады.

Immunoelectrophoresis is a general term describing many combinations of the principles of electrophoresis and reaction of antibodies, also known as immunodiffusion. Agarose as 1% gel slabs of about 1 mm thickness buffered at high pH (around 8.6) is traditionally preferred for electrophoresis and the reaction with antibodies. The agarose was chosen as the gel matrix because it has large pores allowing free passage and separation of proteins but provides an anchor for the immunoprecipitates of protein and specific antibodies. The high pH was chosen because antibodies are practically immobile at high pH. Electrophoresis equipment with a horizontal cooling plate was normally recommended for the electrophoresis. Immunoprecipitates are visible in the wet agarose gel, but are stained with protein stains like Coomassie brilliant blue in the dried gel. In contrast to SDS gel electrophoresis, the electrophoresis in agarose allows native conditions, preserving the native structure and activities of the proteins under investigation, therefore immunoelectrophoresis allows characterization of enzyme activities and ligand binding etc. in addition to electrophoretic separation. Counterimmunoelectrophoresis is the combination of immunodiffusion with electrophoresis. In essence electrophoresis speeds up the process of moving the reactants together. The immunoelectrophoretic analysis ad modum Grabar is the classical method of immunoelectrophoresis. Proteins are separated by electrophoresis, then antibodies are applied in a trough next to the separated proteins and immunoprecipitates are formed after a period of diffusion of the separated proteins and antibodies against each other. The introduction of the immunoelectrophoretic analysis gave a great boost to protein chemistry, some of the first results were the resolution of proteins in biological fluids and biological extracts. Among the important observations made were the great number of different proteins in serum, the existence of several immunoglobulin classes and their electrophoretic heterogeneity. Crossed immunoelectrophoresis is also called two dimensional quantitative immunoelectrophoresis ad modum Clarke and Freeman or ad modum Laurell. In this method the proteins are first separated during the first dimension electrophoresis, then instead of the diffusion towards the antibodies, the proteins are electrophoresed into an antibody containing gel in the second dimension. Immunoprecipitation will take place during the second dimension electrophorsis and
the immunoprecipitates have a characteristic bell shape, each precipitate representing one antigen, the position of the precipitate being dependent on the amount of protein as well as the amount of specific antibody in the gel, so relative quantification can be performed. The sensitivity and resolving power of crossed immunoelectrophoresis is than that of the classical immunoelectrophoretic analysis and there are multiple variations of the technique useful for various purposes. Crossed immunoelectrophoresis has been used for studies of proteins in biological fluids, particularly human serum, and biological extracts. Rocket immunoelectrophoresis is one dimensional quantitative immunoelectrophoresis. The method has been used for quantitation of human serum proteins before automated methods became available. Fused rocket immunoelectrophoresis is a modification of one dimensional quantitative immunoelectrophorsis used for detailed measurement of proteins in fractions from protein separation experiments. Affinity immunoelectrophoresis is based on changes in the electrophoretic pattern of proteins through specific interaction or complex formation with other macromolecules or ligands. Affinity immunoelectrophoresis has been used for estimation of binding constants, as for instance with lectins or for characterization of proteins with specific features like glycan content or ligand binding. Some variants of affinity immunoelectrophoresis are similar to affinity chromatography by use of immobilized ligands. Binding of ligands. The open structure of the immunoprecipitate in the agarose gel will allow additional binding of radioactively labeled antibodies and other ligands to reveal specific proteins. Application of this possibility has been used for instance for identification of allergens through reaction with immunoglobulin E (IgE) and for identification of glycoproteins with lectins. General comments. Two factors determine that immunoelectrophoretic methods are not widely used. First they are rather work intensive and require some manual expertise. Second they require rather large amounts of polyclonal antibodies. Today gel electrophoresis followed by electroblotting is the preferred method for protein characterization because its ease of operation, its high sensitivity, and its low requirement for specific antibodies. In addition proteins are separated by gel electrophoresis on the basis of their apparent molecular weight, which is not accomplished by immunoelectrophoresis, but nevertheless immunoelectrophoretic methods are still useful when non reducing conditions are needed.