Иммуноэлектрофорез: методы разделения и характеристики белков

Введение

Биохимические методы разделения и характеристики белков

Иммуноэлектрофорез – это общее название для ряда биохимических методов разделения и характеристики белков, основанных на электрофорезе и реакции с антителами. Все варианты иммуноэлектрофореза требуют иммуноглобулинов, также известных как антитела, реагирующих с белками, подлежащими разделению или характеристике. Методы были разработаны и широко использовались во второй половине 20-го века. В некотором хронологическом порядке: иммуноэлектрофоретический анализ (одномерный иммуноэлектрофорез по Грабару), перекрестный иммуноэлектрофорез (двухмерный количественный иммуноэлектрофорез по Кларку и Фримену или по Лореллу), ракетный иммуноэлектрофорез (одномерный количественный иммуноэлектрофорез по Лореллу), комбинированный ракетный иммуноэлектрофорез по Свендсену и Харбо, аффинный иммуноэлектрофорез по Бёгу Хансену.

Методы

Иммуноэлектрофорез – общий термин, описывающий множество комбинаций принципов электрофореза и реакции антител, также известных как иммунодиффузия. Агарозу в виде 1% гелевых пластин толщиной около 1 мм, буферированную при высоком pH (около 8,6), традиционно предпочитают для электрофореза и реакции с антителами. Агароза была выбрана в качестве гелевой матрицы, поскольку она имеет большие поры, позволяющие свободно проходить и разделять белки, но обеспечивает основу для иммунопреципитатов белка и специфических антител. Высокий pH был выбран, поскольку антитела практически неподвижны при высоком pH. Для электрофореза обычно рекомендуется оборудование с горизонтальной охлаждающей пластиной. Иммунопреципитаты видны в влажном геле агарозы, но окрашиваются белковыми красителями, такими как Coomassie brilliant blue в высушенном геле. В отличие от SDS-электрофореза, электрофорез в агарозе позволяет поддерживать нативные условия, сохраняя нативную структуру и активность исследуемых белков, поэтому иммуноэлектрофорез позволяет характеризовать активность ферментов и связывание лигандов и т.д. в дополнение к электрофоретическому разделению. Контриммуноэлектрофорез – это сочетание иммунодиффузии с электрофорезом. По сути, электрофорез ускоряет процесс сближения реагентов. Иммуноэлектрофоретический анализ по Грабару – классический метод иммуноэлектрофореза. Белки разделяются электрофорезом, затем антитела наносятся в лунку рядом с разделенными белками, и после периода диффузии разделенных белков и антител друг к другу образуются иммунопреципитаты. Введение иммуноэлектрофоретического анализа дало значительный толчок развитию протеомики, некоторые из первых результатов включали разделение белков в биологических жидкостях и биологических экстрактах. Важными наблюдениями стали большое количество различных белков в сыворотке, существование нескольких классов иммуноглобулинов и их электрофоретическая гетерогенность. Скрещенный иммуноэлектрофорез также называют двумерным количественным иммуноэлектрофорезом по Кларку и Фримену или по Лореллу. В этом методе белки сначала разделяются в ходе электрофореза первого измерения, затем вместо диффузии к антителам белки электрофоретически вводятся в гель, содержащий антитела, во втором измерении. Иммунопреципитация происходит во время электрофореза второго измерения, и иммунопреципитаты имеют характерную форму колокола, каждый осадок представляет один антиген, положение осадка зависит от количества белка, а также от количества специфического антитела в геле, поэтому можно провести относительную количественную оценку. Чувствительность и разрешающая способность скрещенного иммуноэлектрофореза выше, чем у классического иммуноэлектрофоретического анализа, и существует множество вариантов техники, полезных для различных целей. Скрещенный иммуноэлектрофорез использовался для изучения белков в биологических жидкостях, особенно в сыворотке человека, и биологических экстрактах. Ракетный иммуноэлектрофорез – это одномерный количественный иммуноэлектрофорез. Метод использовался для количественного определения белков сыворотки человека до появления автоматизированных методов. Ракетный иммуноэлектрофорез с плавлеными ракетами является модификацией одномерного количественного иммуноэлектрофореза, используемой для детального измерения белков во фракциях, полученных в экспериментах по разделению белков. Аффинный иммуноэлектрофорез основан на изменениях электрофоретической картины белков в результате специфического взаимодействия или образования комплексов с другими макромолекулами или лигандами. Аффинный иммуноэлектрофорез использовался для оценки констант связывания, например, с лектинами, или для характеристики белков со специфическими особенностями, такими как содержание гликанов или связывание лигандов. Некоторые варианты аффинного иммуноэлектрофореза аналогичны аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных лигандов. Связывание лигандов. Открытая структура иммунопреципитата в геле агарозы позволяет дополнительно связывать радиоактивно меченые антитела и другие лиганды для выявления специфических белков. Эта возможность использовалась, например, для идентификации аллергенов путем реакции с иммуноглобулином E (IgE) и для идентификации гликопротеинов с лектинами. Общие замечания. Два фактора определяют, что иммуноэлектрофоретические методы не получили широкого распространения. Во-первых, они довольно трудоемки и требуют определенного опыта. Во-вторых, они требуют относительно больших количеств поликлональных антител. Сегодня гель-электрофорез с последующим электропереносом является предпочтительным методом для характеристики белков благодаря простоте проведения, высокой чувствительности и низким требованиям к специфическим антителам. Кроме того, белки разделяются гель-электрофорезом на основе их кажущейся молекулярной массы, чего нельзя достичь с помощью иммуноэлектрофореза, однако иммуноэлектрофоретические методы все еще полезны, когда необходимы невосстанавливающие условия.

Immunoelectrophoresis is a general term describing many combinations of the principles of electrophoresis and reaction of antibodies, also known as immunodiffusion. Agarose as 1% gel slabs of about 1 mm thickness buffered at high pH (around 8.6) is traditionally preferred for electrophoresis and the reaction with antibodies. The agarose was chosen as the gel matrix because it has large pores allowing free passage and separation of proteins but provides an anchor for the immunoprecipitates of protein and specific antibodies. The high pH was chosen because antibodies are practically immobile at high pH. Electrophoresis equipment with a horizontal cooling plate was normally recommended for the electrophoresis. Immunoprecipitates are visible in the wet agarose gel, but are stained with protein stains like Coomassie brilliant blue in the dried gel. In contrast to SDS gel electrophoresis, the electrophoresis in agarose allows native conditions, preserving the native structure and activities of the proteins under investigation, therefore immunoelectrophoresis allows characterization of enzyme activities and ligand binding etc. in addition to electrophoretic separation. Counterimmunoelectrophoresis is the combination of immunodiffusion with electrophoresis. In essence electrophoresis speeds up the process of moving the reactants together. The immunoelectrophoretic analysis ad modum Grabar is the classical method of immunoelectrophoresis. Proteins are separated by electrophoresis, then antibodies are applied in a trough next to the separated proteins and immunoprecipitates are formed after a period of diffusion of the separated proteins and antibodies against each other. The introduction of the immunoelectrophoretic analysis gave a great boost to protein chemistry, some of the first results were the resolution of proteins in biological fluids and biological extracts. Among the important observations made were the great number of different proteins in serum, the existence of several immunoglobulin classes and their electrophoretic heterogeneity. Crossed immunoelectrophoresis is also called two dimensional quantitative immunoelectrophoresis ad modum Clarke and Freeman or ad modum Laurell. In this method the proteins are first separated during the first dimension electrophoresis, then instead of the diffusion towards the antibodies, the proteins are electrophoresed into an antibody containing gel in the second dimension. Immunoprecipitation will take place during the second dimension electrophorsis and
the immunoprecipitates have a characteristic bell shape, each precipitate representing one antigen, the position of the precipitate being dependent on the amount of protein as well as the amount of specific antibody in the gel, so relative quantification can be performed. The sensitivity and resolving power of crossed immunoelectrophoresis is than that of the classical immunoelectrophoretic analysis and there are multiple variations of the technique useful for various purposes. Crossed immunoelectrophoresis has been used for studies of proteins in biological fluids, particularly human serum, and biological extracts. Rocket immunoelectrophoresis is one dimensional quantitative immunoelectrophoresis. The method has been used for quantitation of human serum proteins before automated methods became available. Fused rocket immunoelectrophoresis is a modification of one dimensional quantitative immunoelectrophorsis used for detailed measurement of proteins in fractions from protein separation experiments. Affinity immunoelectrophoresis is based on changes in the electrophoretic pattern of proteins through specific interaction or complex formation with other macromolecules or ligands. Affinity immunoelectrophoresis has been used for estimation of binding constants, as for instance with lectins or for characterization of proteins with specific features like glycan content or ligand binding. Some variants of affinity immunoelectrophoresis are similar to affinity chromatography by use of immobilized ligands. Binding of ligands. The open structure of the immunoprecipitate in the agarose gel will allow additional binding of radioactively labeled antibodies and other ligands to reveal specific proteins. Application of this possibility has been used for instance for identification of allergens through reaction with immunoglobulin E (IgE) and for identification of glycoproteins with lectins. General comments. Two factors determine that immunoelectrophoretic methods are not widely used. First they are rather work intensive and require some manual expertise. Second they require rather large amounts of polyclonal antibodies. Today gel electrophoresis followed by electroblotting is the preferred method for protein characterization because its ease of operation, its high sensitivity, and its low requirement for specific antibodies. In addition proteins are separated by gel electrophoresis on the basis of their apparent molecular weight, which is not accomplished by immunoelectrophoresis, but nevertheless immunoelectrophoretic methods are still useful when non reducing conditions are needed.