Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Молекулалық биология техникасы
Molecular biology technique
Оңтүстік-батыс блоты – зертханалық техника, ол ДНК-ға байланысатын ақуыздарды белгілі бір олигонуклеотидтік зондтарға байланысу қабілеті арқылы анықтау және сипаттауды қамтиды. Бұл техника ДНК-ға байланысатын ақуыздардың молекулалық салмағын анықтауға да мүмкіндік береді. Атауының шығу тегі – ДНК және ақуыздарды анықтауға арналған оңтүстік және батыс блотинг әдістерінің идеяларының бірігуінен туындайды. Басқа блотинг түрлеріне ұқсас, ақуыздар SDS-PAGE арқылы бөлінеді және одан кейін нитроцеллюлозалық мембраналарға көшіріледі. Одан кейін оңтүстік-батыс блоты процедуралық тұрғыдан өзгере бастайды, себебі алғашқы блотингтерден бері нәтижелерді жақсарту мақсатында көптеген ұсыныстар мен жаңалықтар пайда болды. Бұрынғы протоколдар ақуыздардың көп мөлшерін қажет ету және оқшауланған кезде ыдырауға бейімділік сияқты қиындықтарға тап болды. Оңтүстік-батыс блотын алғаш рет 1979 жылы Брайан Боуэн, Джей Стейнберг, У.К. Лэммли және Гарольд Вайнтрауб сипаттады. Бұл техника бастапқыда "ақуыз блоты" деп аталды. ДНК-мен байланысты ақуыздарды тазартудың бұрыннан бар әдістері болғанмен, көбінесе қажетті нәтиже алу үшін оларды бірге қолдану қажет болды. Сондықтан Боуэн және оның әріптестері сол кездегі қолданылып жүрген әдістерді жеңілдететін процедураны сипаттауға тырысты.
The southwestern blot, is a lab technique that involves identifying as well as characterizing DNA binding proteins by their ability to bind to specific oligonucleotide probes. Determination of molecular weight of proteins binding to DNA is also made possible by the technique. The name originates from a combination of ideas underlying Southern blotting and Western blotting techniques of which they detect DNA and protein respectively. Similar to other types of blotting, proteins are separated by SDS PAGE and are subsequently transferred to nitrocellulose membranes. Thereafter southwestern blotting begins to vary with regards to procedure as since the first blotting’s, many more have been proposed and discovered with goals of enhancing results. Former protocols were hampered by the need for large amounts of proteins and their susceptibility to degradation while being isolated. Southwestern blotting was first described by Brian Bowen, Jay Steinberg, U. K. Laemmli, and Harold Weintraub in 1979. During the time the technique was originally called "protein blotting". While there were existing techniques for purification of proteins associated with DNA, they often had to be used together to yield desired results. Thus, Bowen and colleagues sought to describe a procedure that could simplify the current methods of their time.
Бастапқы әдіс
Бастапқыда, қызығушылық тудыратын ақуыздар SDS PAGE техникасы үшін дайындалады, содан кейін молекулалық мөлшеріне сәйкес бөлу үшін гельге салынады. Ірі ақуыздар гельдің торлы құрылымынан өтуде қиындыққа тап болады, себебі олар кіші ақуыздар сияқты тесіктер арқылы оңай өтпейді. Осының салдарынан, ірі ақуыздар кіші ақуыздарға қарағанда гельде аз қашықтыққа жылжиды. Белгілі бір уақыт өткен соң, бұл гельдік электрофорезден кейін жүзеге асырылатын бояу процедуралары арқылы көрінетін анық жолақтардың пайда болуына әкеледі. Жолақтар гельдегі орналасуымен, олар салынатын ұяшаға қатысты ерекшеленеді. Келесі қадамда ақуыздар қайтадан денатурацияланады, содан кейін гель екі нитроцеллюлозалық сүзгінің арасына қысылады, бұл белоктарды гельден мембраналық сүзгілерге диффузия арқылы көшіруге мүмкіндік береді. Осы кезде гельдің әрқайсысы нақты бір мақсатқа қызмет ететін көшірмелері жасалады. Бір мембраналық сүзгіге гельдік электрофорез нәтижесінде пайда болған ақуыздық жолақтарды көру үшін бояу жағылуы мүмкін, ал екіншісі дайындалған 32P радиоактивті белгіленген нақты олигонуклеотидтік зондтармен гибридтеудің өзінде қолданылады. Ақуыз-ДНК өзара әрекеттесуін анықтау үшін авторадиография кеңінен қолданылады.
To begin, proteins of interest are prepared for the SDS PAGE technique and subsequently loaded onto the gel for separation on the basis of molecular size. Large proteins will have difficulty navigating through the mesh like structure of the gel as they can not fit through the pores with the ease that smaller proteins can. As a result, large proteins do not travel very far on the gel in comparison to smaller proteins that travel further. After enough time, this results in distinct bands that can be visualized from a number of post gel electrophoresis staining procedures. The bands are at different positions on the gel relative to the well that they were loaded into. Next, proteins are to be renatured followed by the gel being subjected to pressed between two nitrocellulose filters which rely on diffusion to transfer the proteins from the gel to the membrane filters. At this point replicas of the gel have been created of which each serves a particular purpose. One membrane filter can be stained to see the protein bands that were created from gel electrophoresis and the other is used in the actual process of hybridizing with prepared 32P radioactively labeled specific oligonucleotide probes. To detect any protein DNA interactions, autoradiography is commonly used.
Оңтүстік-батыс Блот картасы
"Оңтүстік-батыс блот картасы" – ДНК-мен байланысатын ақуыздарды және олардың геномдық ДНК-дағы нақты байланысқан жерлерін анықтаудың уақытты үнемдейтін әдісі. Біріншіден, ақуыздар денатурациялайтын натрий додецил сульфаты (SDS) қосылған қоспамен дайындалады. Бұл әрекет ақуыздарды бүктелген күйден түзу күйге келтіріп қана қоймай, олардың арасында біркелкі зарядты қалыптастырады, соның нәтижесінде полиакриламид гельінде (PAGE) мөлшері бойынша бөлу жеңілдеді. Екіншіден, бұрынғы қадамнан өзгеше, алынған гельдегі ақуыздар SDS-ті жою арқылы қайта бүктеледі. Бұл ақуыздарды кейінірек максималды өзара әрекеттесуге мүмкіндік беретін күйге келтіруге себіміз береді. Үшіншіден, диффузия әдістерін қолдана отырып, нитроцеллюлоза мембраналарына блоттинг жасалады. Төртіншіден, зонд жасау үшін нақты шектеу ферменттері таңдалып, зерттелетін ДНК аймағында қолданылып, қажетті, бірақ әртүрлі өлшемдегі фрагменттер алынады. Бесіншіден, фрагменттер радиоактивті белгіленеді және бұрын дайындалған блоттармен байланысу үшін белгілі бір уақыт беріледі. Осы уақыт өткен соң, байланыспаған ДНК-ны жою үшін блоттар жуылады. Соңында, нақты байланысқан ДНК әрбір жеке ақуыз-ДНК кешенінен бөліп алынып, полиакриламид гельдік электрофорез арқылы талданады.
"Southwestern blot mapping" is a time efficient way of identifying DNA binding proteins and specific sites on the genomic DNA that they interact with. First, proteins are prepared with a mixture that exposes them to the denaturing sodium dodecyl sulfate (SDS) agent. This exposure not only converts the proteins from a folded conformation to an unfolded conformation but also establishes uniform charge among them as well contributing to the ease of separation on a size basis using polyacrylamide gel (PAGE). Second, in contrast to the previous step, proteins on the resulting gel are to be renatured by removal of SDS. This serves to bring the proteins back to the form that ideally maximizes interactions later on in the procedure. Third, blotting takes place onto nitrocellulose membranes using methods for and properties of diffusion. Fourth, shifting to probe creation, particular restriction enzymes are chosen and used on the region of DNA under study to produce fragments of appropriate but different sizes. Fifth, the fragments are radioactively labeled and given appropriate time for binding to previously prepared blots. Once this time has elapsed, the blots are washed to remove any DNA that was not able to bind. Finally, the specifically bound DNA is eluted from each individual protein DNA complex and analyzed by another application of polyacrylamide gel electrophoresis.
Нәтижелер
Олигонуклеотидтік зондтармен байланысуға уақыт берілгеннен кейін, мембраналық сүзгідегі кейбір ақуыздар зондтарға байланысқан болар деген үміт бар. Зондтардың бірі де ақуызға байланыса алмаса, оны алып тастау қажет. Байланбаған зондтарды жою жұмысы аяқталғаннан кейін, мембраналық сүзгіні жақсы көру үшін оған әртүрлі процедуралар қолданылады. Пайда болған мембраналық сүзгіні гельдің арасында болған екінші мембраналық сүзгімен салыстыру арқылы, молекулалық салмақ шкаласына қарағанда ақуыздың орны, зондқа байланысқан ақуыздың салмағы туралы мәлімет береді.
After time is allowed for binding with the oligonucleotide probes, the hope is that some of the proteins on the membrane filter have bound to the probes. Any probe that was not able to bind a protein needs to be removed. Once unbound probe removal has been taken care of, to better visualize the membrane filter, it is subjected to further varying procedures. By corresponding the resulting membrane filter to the second membrane filter that the gel was sandwiched between, the position of the protein in comparison to the molecular weight ladder gives information about the weight of the protein that bound to the probe.
Әдіс-тәсілдерді өзгерту
Стандартты диффузияға сүйенудің орнына, ақуыздарды гельден сүзгіге көшіру үшін көбінесе электроблоттинг қолданылады, себебі ол денатурациялайтын SDS агентін жояды, соның арқасында ақуыздар сүзгіге жылжығанда қайта құрылымдалады. Изоэлектрлік нүктені анықтау стандартты бір өлшемді емес, 2D SDS PAGE пайдалану арқылы мүмкін.
Instead of relying on standard diffusion to transfer the proteins from the gel to the filter, electroblotting is commonly used because it removes the denaturing agent SDS thereby allowing the proteins to renature as they move to the filter. Isoelectric point determination is possible through the use of 2D SDS PAGE instead of the standard one dimension.
Әлеуетті
Блоттарды қайта пайдалану мәселесін шешу, белгілі бір олигонуклеотидтік зондтың радиоактивті таңбалауын өзгерту арқылы зондтың мутанттарының ақуыздармен байланысу дәрежесін зерттеуге мүмкіндік береді. Олигонуклеотидтер SDS PAGE геліне еніп, ақуыздармен байланыса алмайды, сондықтан блоттап тасу қадамының маңыздылығы артады. Бірақ, егер «ақуызды ажыратуға және олигонуклеотидтерге өткізгіш» гельдер жасалса, онда бұл қадам қажет болмауы мүмкін. Мұндай гельдерге қызығушылық тудыратын олигонуклеотидтік зондтар еніп, ақуыздармен байланыса алады, бұл әдістің қадамдарын азайтып, нәтижелерді бір орында ұстауға көмектеседі. ДНК-ға тіндік ерекшелікпен байланысатын ақуыздарды оңтүстік-батыс блот картасын пайдалану арқылы анықтауға болатындығына дәлелдер бар. Сонымен қатар, олардың тізбектік ерекше байланысуы сәйкес келетін, таңдамалы байланысқан ДНК фрагменттерін тазартуға және ДНК реттеуші тізбектерін ақуыз арқылы клондауды жақсартуға мүмкіндік береді.
Overcoming the reusability challenge with the blots, can allow for the use of a particular oligonucleotide probe where the radioactive labeling is varied to study the degree of binding that mutants of the probe possess with proteins. Oligonucleotides are not able to penetrate the gel of SDS PAGE to bind to the proteins which stresses the importance of having the blotting step. However, it may not be needed if "protein resolving oligonucleotide permeable" gels are created. With such gels, oligonucleotide probes of interest could enter the gels and bind to the proteins minimizing steps of the technique while keeping results in one place. There is evidence that tissue specific DNA binding proteins can be identified by use of southwestern blot mapping. Moreover, their sequence specific binding allows the purification of the corresponding selectively bound DNA fragments and may improve protein mediated cloning of DNA regulatory sequences.