Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Метод молекулярной биологии
Molecular biology technique
Юго-западный блот – это лабораторный метод, который позволяет идентифицировать и характеризовать белки, связывающие ДНК, по их способности связываться со специфическими олигонуклеотидными зондами. Метод также позволяет определять молекулярный вес белков, связывающихся с ДНК. Название происходит от объединения принципов, лежащих в основе методов саузерн-блоттинга и вестерн-блоттинга, которые используются для обнаружения ДНК и белка соответственно. Как и другие виды блоттинга, белки разделяются с помощью SDS-PAGE и затем переносятся на нитроцеллюлозные мембраны. Далее процедура юго-западного блоттинга может варьироваться, поскольку с момента разработки первоначального метода было предложено множество модификаций, направленных на улучшение результатов. Ранние протоколы были затруднены необходимостью использования больших количеств белков и их подверженностью деградации в процессе выделения. Юго-западный блот впервые был описан Брайаном Боуэном, Джеем Стейнбергом, У.К. Лэммли и Гарольдом Вайнтраубом в 1979 году. В то время метод первоначально назывался "протеиновым блоттингом". Хотя существовали методы очистки белков, ассоциированных с ДНК, их часто приходилось комбинировать для получения желаемых результатов. Таким образом, Боуэн и его коллеги стремились разработать процедуру, которая упростила бы существующие методы того времени.
The southwestern blot, is a lab technique that involves identifying as well as characterizing DNA binding proteins by their ability to bind to specific oligonucleotide probes. Determination of molecular weight of proteins binding to DNA is also made possible by the technique. The name originates from a combination of ideas underlying Southern blotting and Western blotting techniques of which they detect DNA and protein respectively. Similar to other types of blotting, proteins are separated by SDS PAGE and are subsequently transferred to nitrocellulose membranes. Thereafter southwestern blotting begins to vary with regards to procedure as since the first blotting’s, many more have been proposed and discovered with goals of enhancing results. Former protocols were hampered by the need for large amounts of proteins and their susceptibility to degradation while being isolated. Southwestern blotting was first described by Brian Bowen, Jay Steinberg, U. K. Laemmli, and Harold Weintraub in 1979. During the time the technique was originally called "protein blotting". While there were existing techniques for purification of proteins associated with DNA, they often had to be used together to yield desired results. Thus, Bowen and colleagues sought to describe a procedure that could simplify the current methods of their time.
Первоначальный метод
Для начала, интересующие белки подготавливаются к методу SDS-PAGE и затем загружаются в гель для разделения на основе молекулярного веса. Крупные белки будут испытывать затруднения при перемещении сквозь сетчатую структуру геля, так как они не могут проходить через поры так же легко, как более мелкие белки. В результате, крупные белки проходят по гелю на меньшее расстояние по сравнению с мелкими белками, которые проходят дальше. После достаточного времени это приводит к формированию отчетливых полос, которые можно визуализировать с помощью различных процедур окрашивания после электрофореза в геле. Полосы располагаются на разных позициях на геле относительно лунки, в которую они были загружены. Далее белки необходимо ренатурировать, после чего гель помещают между двумя нитроцеллюлозными фильтрами, использующими диффузию для переноса белков из геля на мембранные фильтры. Таким образом создаются реплики геля, каждая из которых служит определенной цели. Один мембранный фильтр можно окрасить для визуализации белковых полос, полученных в результате электрофореза в геле, а другой используется непосредственно в процессе гибридизации с подготовленными 32P-радиоактивно мечеными специфическими олигонуклеотидными зондами. Для выявления любых взаимодействий между белком и ДНК обычно применяется авторадиография.
To begin, proteins of interest are prepared for the SDS PAGE technique and subsequently loaded onto the gel for separation on the basis of molecular size. Large proteins will have difficulty navigating through the mesh like structure of the gel as they can not fit through the pores with the ease that smaller proteins can. As a result, large proteins do not travel very far on the gel in comparison to smaller proteins that travel further. After enough time, this results in distinct bands that can be visualized from a number of post gel electrophoresis staining procedures. The bands are at different positions on the gel relative to the well that they were loaded into. Next, proteins are to be renatured followed by the gel being subjected to pressed between two nitrocellulose filters which rely on diffusion to transfer the proteins from the gel to the membrane filters. At this point replicas of the gel have been created of which each serves a particular purpose. One membrane filter can be stained to see the protein bands that were created from gel electrophoresis and the other is used in the actual process of hybridizing with prepared 32P radioactively labeled specific oligonucleotide probes. To detect any protein DNA interactions, autoradiography is commonly used.
Картография юго-западных пятен
"Маппинг с помощью саутерн-блота" – это эффективный по времени способ идентификации белков, связывающих ДНК, и специфических участков геномной ДНК, с которыми они взаимодействуют. Сначала белки подготавливают с использованием смеси, которая подвергает их воздействию денатурирующего агента – додецилсульфата натрия (SDS). Это воздействие не только переводит белки из сложенной конформации в развернутую, но и обеспечивает им однородный заряд, что облегчает разделение по размеру с помощью полиакриламидного гельного электрофореза (PAGE). Далее, в отличие от предыдущего этапа, белки на полученном геле ренатурируют путем удаления SDS. Это необходимо для возвращения белков в форму, оптимально обеспечивающую взаимодействие на последующих стадиях процедуры. Затем проводят блоттинг на нитроцеллюлозные мембраны, используя методы и свойства диффузии. После этого приступают к созданию зондов: выбирают определенные рестрикционные ферменты и используют их для фрагментации изучаемого участка ДНК, получая фрагменты подходящего, но различного размера. Затем фрагменты радиоактивно ме́тят и дают достаточно времени для связывания с предварительно подготовленными блотами. По истечении этого времени блоты промывают для удаления ДНК, не вступившей в связывание. Наконец, специфически связанная ДНК элюируется из каждого белково-ДНК комплекса и анализируется повторным полиакриламидным гельным электрофорезом.
"Southwestern blot mapping" is a time efficient way of identifying DNA binding proteins and specific sites on the genomic DNA that they interact with. First, proteins are prepared with a mixture that exposes them to the denaturing sodium dodecyl sulfate (SDS) agent. This exposure not only converts the proteins from a folded conformation to an unfolded conformation but also establishes uniform charge among them as well contributing to the ease of separation on a size basis using polyacrylamide gel (PAGE). Second, in contrast to the previous step, proteins on the resulting gel are to be renatured by removal of SDS. This serves to bring the proteins back to the form that ideally maximizes interactions later on in the procedure. Third, blotting takes place onto nitrocellulose membranes using methods for and properties of diffusion. Fourth, shifting to probe creation, particular restriction enzymes are chosen and used on the region of DNA under study to produce fragments of appropriate but different sizes. Fifth, the fragments are radioactively labeled and given appropriate time for binding to previously prepared blots. Once this time has elapsed, the blots are washed to remove any DNA that was not able to bind. Finally, the specifically bound DNA is eluted from each individual protein DNA complex and analyzed by another application of polyacrylamide gel electrophoresis.
Результаты
После того, как предоставлено время для связывания с олигонуклеотидными зондами, предполагается, что некоторые белки на мембранном фильтре связались с этими зондами. Любые зонды, которые не смогли связаться с белком, необходимо удалить. После удаления несвязавшихся зондов, для лучшей визуализации мембранного фильтра его подвергают дальнейшим различным процедурам. Сопоставляя полученный мембранный фильтр со вторым мембранным фильтром, между которыми находился гель, положение белка относительно шкалы молекулярных весов позволяет определить вес белка, который связался с зондом.
After time is allowed for binding with the oligonucleotide probes, the hope is that some of the proteins on the membrane filter have bound to the probes. Any probe that was not able to bind a protein needs to be removed. Once unbound probe removal has been taken care of, to better visualize the membrane filter, it is subjected to further varying procedures. By corresponding the resulting membrane filter to the second membrane filter that the gel was sandwiched between, the position of the protein in comparison to the molecular weight ladder gives information about the weight of the protein that bound to the probe.
Изменения в методе
Вместо использования стандартной диффузии для переноса белков из геля на фильтр, обычно применяется электрофоретическое переноса (электроблоттинг), поскольку он удаляет денатурирующее средство SDS, что позволяет белкам восстанавливать свою нативную структуру по мере их перемещения на фильтр. Определение изоэлектрической точки возможно с помощью двумерного SDS-PAGE вместо стандартного одномерного.
Instead of relying on standard diffusion to transfer the proteins from the gel to the filter, electroblotting is commonly used because it removes the denaturing agent SDS thereby allowing the proteins to renature as they move to the filter. Isoelectric point determination is possible through the use of 2D SDS PAGE instead of the standard one dimension.
Потенциал
Преодоление проблемы повторного использования блот-мембран может позволить использовать конкретный олигонуклеотидный зонд, варьируя радиоактивную метку для изучения степени связывания мутантов этого зонда с белками. Олигонуклеотиды не способны проникать в гель SDS-PAGE для связывания с белками, что подчеркивает важность этапа переноса на мембрану (блоттинга). Однако, этот этап может оказаться ненужным при создании гелей, проницаемых для олигонуклеотидов и одновременно обеспечивающих разделение белков. С использованием таких гелей, олигонуклеотидные зонды смогут проникать в гель и связываться с белками, упрощая процедуру и сохраняя результаты в одном месте. Имеются данные о том, что белки, специфически связывающие ДНК в различных тканях, могут быть идентифицированы с помощью метода Southwestern blot mapping. Более того, их последовательностно-специфическое связывание позволяет очищать соответствующие селективно связанные фрагменты ДНК и может способствовать клонированию регуляторных последовательностей ДНК при участии белков.
Overcoming the reusability challenge with the blots, can allow for the use of a particular oligonucleotide probe where the radioactive labeling is varied to study the degree of binding that mutants of the probe possess with proteins. Oligonucleotides are not able to penetrate the gel of SDS PAGE to bind to the proteins which stresses the importance of having the blotting step. However, it may not be needed if "protein resolving oligonucleotide permeable" gels are created. With such gels, oligonucleotide probes of interest could enter the gels and bind to the proteins minimizing steps of the technique while keeping results in one place. There is evidence that tissue specific DNA binding proteins can be identified by use of southwestern blot mapping. Moreover, their sequence specific binding allows the purification of the corresponding selectively bound DNA fragments and may improve protein mediated cloning of DNA regulatory sequences.