Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Ақуыз концентрациясын анықтау әдісі
Method to determine protein concentration
Бицинхонин қышқылының (BCA) әдісі, сонымен қатар ойлап тапқан авторы Пол К. Смит есімді Pierce Chemical Company қызметкерінің құрметіне Смит әдісі деп те аталады, қазір Thermo Fisher Scientific компаниясының бөлігі. Бұл әдіс Lowry ақуыз әдісі, Bradford ақуыз әдісі немесе биурет реагенті сияқты, ерітіндідегі (0,5 мкг/мл-ден 1,5 мг/мл-ге дейін) ақуыздың жалпы концентрациясын анықтауға арналған биохимиялық анализ болып табылады. Ақуыз концентрациясының өзгеруіне байланысты сынама ерітіндісінің түсі көктен күлгін түске дейін өзгереді, осы өзгерісті колориметриялық әдістермен өлшеуге болады. BCA әдісі 1989 жылы Pierce Chemical Company компаниясымен патенттелген, ал патент 2006 жылы тоқталды.
The bicinchoninic acid assay (BCA assay), also known as the Smith assay, after its inventor, Paul K. Smith at the Pierce Chemical Company, now part of Thermo Fisher Scientific, is a biochemical assay for determining the total concentration of protein in a solution (0.5 μg/mL to 1.5 mg/mL), similar to Lowry protein assay, Bradford protein assay or biuret reagent. The total protein concentration is exhibited by a color change of the sample solution from blue to purple in proportion to protein concentration, which can then be measured using colorimetric techniques. The BCA assay was patented by Pierce Chemical Company in 1989 & the patent expired in 2006.
Механизм
BCA негізгі ерітіндісі 11,25 pH деңгейіндегі жоғары сілтілік ерітіндіде мынадай ингредиенттерді қамтиды: бицинхонин қышқылы, натрий карбонаты, натрий бикарбонаты, натрий тартраты және мыс(II) сульфат пентагидраты. BCA әсері негізінен екі реакцияға сүйенеді. Біріншіден, ақуыздағы пептидтік байланыстар мыс(II) сульфатынан Cu2+ иондарын Cu1+ иондарына дейін тотықтырады (температураға тәуелді реакция). Тотыққан Cu2+ иондарының мөлшері ерітіндідегі ақуыз мөлшеріне пропорционалды. Екіншіден, екі молекула бицинхонин қышқылы әрбір Cu1+ ионымен келаттасып, күлгін түсті кешен құрайды, ол 562 нм толқын ұзындығында жарықты күшті сіңіреді. Бицинхонин қышқылының Cu1+ кешеніне ақуыз үлгілерінде цистеин/цистин, тирозин және триптофанның жанама тізбектерінің болуы әсер етеді. Жоғары температурада (37-60°C) пептидтік байланыстар реакциялық кешеннің қалыптасуына көмектеседі. BCA әсерін жоғары температурада инкубациялау, әсердің сезімталдығын арттыру және аминқышқылдарының тең емес құрамынан туындайтын айырмашылықтарды азайту үшін ұсынылады. Ерітіндідегі ақуыз мөлшерін сіңіру спектрлерін өлшеу және белгілі концентрациядағы ақуыз ерітінділерімен салыстыру арқылы анықтауға болады.
A stock BCA solution contains the following ingredients in a highly alkaline solution with a pH 11.25: bicinchoninic acid, sodium carbonate, sodium bicarbonate, sodium tartrate, and copper(II) sulfate pentahydrate. The BCA assay primarily relies on two reactions. First, the peptide bonds in protein reduce Cu2+ ions from the copper(II) sulfate to Cu1+ (a temperature dependent reaction). The amount of Cu2+ reduced is proportional to the amount of protein present in the solution. Next, two molecules of bicinchoninic acid chelate with each Cu1+ ion, forming a purple colored complex that strongly absorbs light at a wavelength of 562 nm. The bicinchoninic acid Cu1+ complex is influenced in protein samples by the presence of cysteine/cystine, tyrosine, and tryptophan side chains. At higher temperatures (37 to 60 °C), peptide bonds assist in the formation of the reaction complex. Incubating the BCA assay at higher temperatures is recommended as a way to increase assay sensitivity while minimizing the variances caused by unequal amino acid composition. The amount of protein present in a solution can be quantified by measuring the absorption spectra and comparing with protein solutions of known concentration.
Шектеулер
BCA әдісі көбінесе тотықтырғыштармен және металл байланыстырғыштармен үйлесімсіз, бірақ аздаған мөлшерде көтерілуі мүмкін. Сондай-ақ, BCA сынағының қалыпты жасуша мембранасы липидтері мен фосфолипидтеріне де реакция беретіні хабарланған.
The BCA assay is largely incompatible with reducing agents and metal chelators, although trace quantities may be tolerated. The BCA assay also reportedly responds to common membrane lipids and phospholipids.
Бастапқы BCA өлшемі
Смиттің айтуынша, BCA жұмыс ерітіндісі А реактиві мен В реактивін 50:1 қатынаста араластыру арқылы дайындалады және оны апта сайын (орташа тұрақтылығы бар) немесе қажет болғанда жасауға болады. Сол кездегі коммерциялық жеткізушілерден алынған А реактиві, олардың қолдануы үшін жеткілікті таза болмады. Сынақ үшін жеткілікті тазарту үшін, олар синтездеген BCA-ны 70°C судан кем дегенде үш рет қайта кристалдау қажет болды. Ерекше айта кетерлік жайт, Смиттің түпнұсқа қолжазбасында "Микро BCA реактивтері мен протоколының" құрамы мен қолданылуы сипатталған, ол Редукциялық агенттермен үйлесімділік агенті (RACA) ретінде белгілі. Бұл редукциялық заттармен жақсы үйлесімділікті қамтамасыз етеді, бірақ басқа белок емес компоненттерден өзгеше кедергі профиліне ие. Бұл эксклюзивті хелатор және болжамды оңтайландырылған Биуре реакциясының формуласы, сынаққа бастапқы BCA сынағының 37°C-тан жоғары температурадағы инкубациясынсыз (<5 мин) жылдам нәтижелер беруге мүмкіндік береді. Дегенмен, бұл сынақтың басқа белок емес компоненттерден өзгеше кедергі профилі бар.
As described by Smith, The BCA Working solution is generated by mixing Reagent A and Reagent B in a 50:1 ratio, and can be prepared either weekly (it is moderately stable), or as needed. Reagent A as the BCA available from commercial vendors of that time was too impure for their use. At least three successive recrystallizations of their synthesized BCA from 70˚C water was needed to sufficiently purify it for the assay. Notably, the composition and use of a "Micro BCA Reagent and Protocol" was described in the original manuscript by Smith, aka a Reducing Agent Compatibility Agent (RACA). Although this allows greater compatibility with reducing agents, the assay has a different interference profile from other non protein components. This proprietor chelator and presumed optimized Biuret reaction formulation allows the assay to provide rapid (<5 min) results without the 37˚C+ incubation of the original BCA assay. However the assay has a different interference profile from other non protein components.