Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Метод определения концентрации белка
Method to determine protein concentration
Анализ бицинхониновой кислоты (BCA-анализ), также известный как метод Смита, по имени его изобретателя Пола К. Смита из компании Pierce Chemical Company, ныне входящей в Thermo Fisher Scientific, является биохимическим анализом для определения общей концентрации белка в растворе (от 0,5 мкг/мл до 1,5 мг/мл), аналогично анализу белка Лоури, анализу белка Брэдфорда или биуретовому реагенту. Общая концентрация белка проявляется в изменении цвета раствора образца от голубого к фиолетовому пропорционально концентрации белка, которое затем можно измерить колориметрическими методами. BCA-анализ был запатентован компанией Pierce Chemical Company в 1989 году, а срок действия патента истек в 2006 году.
The bicinchoninic acid assay (BCA assay), also known as the Smith assay, after its inventor, Paul K. Smith at the Pierce Chemical Company, now part of Thermo Fisher Scientific, is a biochemical assay for determining the total concentration of protein in a solution (0.5 μg/mL to 1.5 mg/mL), similar to Lowry protein assay, Bradford protein assay or biuret reagent. The total protein concentration is exhibited by a color change of the sample solution from blue to purple in proportion to protein concentration, which can then be measured using colorimetric techniques. The BCA assay was patented by Pierce Chemical Company in 1989 & the patent expired in 2006.
Механизм
Основной раствор BCA содержит следующие ингредиенты в сильнощелочном растворе с pH 11,25: бицинхониновую кислоту, карбонат натрия, бикарбонат натрия, тартрат натрия и пентагидрат сульфата меди(II). Анализ BCA основан главным образом на двух реакциях. Во-первых, пептидные связи в белке восстанавливают ионы Cu2+ из сульфата меди(II) до Cu1+ (температурозависимая реакция). Количество восстановленного Cu2+ пропорционально количеству белка в растворе. Затем две молекулы бицинхониновой кислоты хелатируют каждый ион Cu1+, образуя фиолетовый комплекс, сильно поглощающий свет на длине волны 562 нм. На комплекс бицинхониновой кислоты с Cu1+ в белковых образцах влияют боковые цепи цистеина/цистина, тирозина и триптофана. При более высоких температурах (от 37 до 60 °C) пептидные связи способствуют образованию реакционного комплекса. Инкубирование анализа BCA при повышенных температурах рекомендуется для повышения чувствительности анализа и минимизации вариаций, вызванных неравномерным аминокислотным составом. Количество белка в растворе можно количественно определить, измеряя спектры поглощения и сравнивая их со спектрами белковых растворов известной концентрации.
A stock BCA solution contains the following ingredients in a highly alkaline solution with a pH 11.25: bicinchoninic acid, sodium carbonate, sodium bicarbonate, sodium tartrate, and copper(II) sulfate pentahydrate. The BCA assay primarily relies on two reactions. First, the peptide bonds in protein reduce Cu2+ ions from the copper(II) sulfate to Cu1+ (a temperature dependent reaction). The amount of Cu2+ reduced is proportional to the amount of protein present in the solution. Next, two molecules of bicinchoninic acid chelate with each Cu1+ ion, forming a purple colored complex that strongly absorbs light at a wavelength of 562 nm. The bicinchoninic acid Cu1+ complex is influenced in protein samples by the presence of cysteine/cystine, tyrosine, and tryptophan side chains. At higher temperatures (37 to 60 °C), peptide bonds assist in the formation of the reaction complex. Incubating the BCA assay at higher temperatures is recommended as a way to increase assay sensitivity while minimizing the variances caused by unequal amino acid composition. The amount of protein present in a solution can be quantified by measuring the absorption spectra and comparing with protein solutions of known concentration.
Ограничения
Анализ BCA в значительной степени несовместим с восстановителями и хелатирующими агентами, хотя незначительные количества могут быть допустимы. Также сообщается, что анализ BCA реагирует на распространенные мембранные липиды и фосфолипиды.
The BCA assay is largely incompatible with reducing agents and metal chelators, although trace quantities may be tolerated. The BCA assay also reportedly responds to common membrane lipids and phospholipids.
Оригинальный анализ BCA
Как описано Смитом, рабочий раствор BCA получают путем смешивания реагента А и реагента В в соотношении 50:1, и его можно готовить либо еженедельно (он умеренно стабилен), либо по мере необходимости. Реагент А, как и доступный в то время у коммерческих поставщиков BCA, был слишком нечистым для их использования. Для достаточной очистки синтезированного ими BCA потребовалось провести как минимум три последовательные перекристаллизации из воды при 70 ̊C. Важно отметить, что состав и применение "Микро-БКА-реагента и протокола" были описаны в оригинальной рукописи Смита, также известного как агент совместимости с восстановителями (RACA). Хотя это обеспечивает большую совместимость с восстановителями, анализ имеет иной профиль интерференции от других небелковых компонентов. Этот запатентованный хелатор и предполагаемая оптимизированная формула реакции Биурета позволяют анализу давать быстрые (<5 мин) результаты без инкубации при 37 ̊C и выше, необходимой в оригинальном анализе BCA. Однако анализ имеет иной профиль интерференции от других небелковых компонентов.
As described by Smith, The BCA Working solution is generated by mixing Reagent A and Reagent B in a 50:1 ratio, and can be prepared either weekly (it is moderately stable), or as needed. Reagent A as the BCA available from commercial vendors of that time was too impure for their use. At least three successive recrystallizations of their synthesized BCA from 70˚C water was needed to sufficiently purify it for the assay. Notably, the composition and use of a "Micro BCA Reagent and Protocol" was described in the original manuscript by Smith, aka a Reducing Agent Compatibility Agent (RACA). Although this allows greater compatibility with reducing agents, the assay has a different interference profile from other non protein components. This proprietor chelator and presumed optimized Biuret reaction formulation allows the assay to provide rapid (<5 min) results without the 37˚C+ incubation of the original BCA assay. However the assay has a different interference profile from other non protein components.