Флуоресценттік микроскопияда коллокализацияны анықтау әдістері мен қиындықтары
Colocalization
Флуоресценттік микроскопияда коллокализация – екі немесе одан көп флуоресценттік белгілердің ғарыштық үйлесімдігін анықтау. М1, М2 коэффициенттері, Пирсон корреляциясы қолданылады.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Флуоресценттік микроскопияда колокализация – екі (немесе одан көп) әр түрлі флуоресценттік маркерлердің кеңістіктік үйлесімділігін байқау, мұнда әрқайсысының бөлек эмиссия толқын ұзындығы болады. Мақсаты – әртүрлі “нысаналардың” жасушаның бір аймағында немесе бір-біріне өте жақын орналасқандығын анықтау. Бұл анықтаманы екі құбылысқа бөлуге болады: ко-оқиға (co-occurrence), яғни бір пикселде екі (қатысы жоқ болуы мүмкін) флуорофордың болуы, және корреляция – флуорофорлар арасындағы биологиялық өзара әрекеттесуді көрсететін маңызды статистикалық байланыс. Басқа коэффициенттермен қатар, “үйлесімділік коэффициенттері” M1 және M2 ең танымал және пайдалы болып табылады. Коэффициенттерді пайдалану мақсаты – әр түрлі эмиссия толқын ұзындығында тіркелген көп өлшемді микроскопиялық кескінде, әдетте екі арнадағы кескіндер арасындағы үйлесімділік деңгейін сипаттау. Бұл тәсілді Сильвен Кост енгізді, ол Пирсонның корреляциялық коэффициентін M1 және M2 үшін қажетті шекті мәндерді объективті түрде белгілеу құралы ретінде пайдаланды. Кост тәсілі тек оң корреляцияларға қызығушылық танытады және PCC-нің пайдалы өлшемін қамтамасыз етпейді. Коэффициенттерді қолдану колокализацияны анықтаудың сенімділігін арттырса да, ол үлгілерді флуоресценциямен дайындау шарттары және колокализация кескіндерін алу және өңдеу сияқты көптеген факторларға байланысты. Зерттеулерді өте мұқият жүргізу керек, алдымен қажетті әдебиеттерді оқып зерттеу қажет. Қазіргі уақытта бұл салада түсініспеушіліктер бар және стандартталған тәсіл әлі толық бекітілмеген. Бұл мәселені шешу үшін кейбір коэффициенттерді қайта қарау, шуды түзету үшін коэффициенттерді қолдану, “дәл колокализация өлшемдері үшін шуға негізделген түзетулерді қайталау” және Болте мен Корделиерс (2006) толық қараған қосымша хаттамалар ұсынылған. Деконволюция арқылы кескінді мұқият қалпына келтіру шуды жояды және кескіндердің контрастын арттырады, колокализация талдауының нәтижелерін жақсартады. Бүгінгі күнге дейін колокализацияны сандық бағалау үшін ең көп қолданылатын әдістер екі түрлі микроскопиялық арнадағы пиксельдік қарқындылықтың статистикалық корреляциясын есептейді. Жақындағы зерттеулер мұның тіпті әртүрлі жасушалық бөлімшелерде орналасқан нысаналар үшін де жоғары корреляциялық коэффициенттерге әкелуі мүмкін екенін көрсетті. Колокализацияны толығырақ бағалау үшін цифрлық нысанды тану, ауданның үйлесімділігін есептеу және пиксельдік қарқындылықпен байланысты мәнді біріктіру қажет. Бұл Пирсонның корреляциялық коэффициентін түзетуге негізделген объектінің тұжырымдамасына әкелді. Нейробиология саласындағы колокализацияны сандық бағалаудың әртүрлі мысалдарына шолуда кездесуге болады. Колокализацияны сандық бағалау бойынша егжей-тегжейлі хаттамалар кітаптың тарауында келтірілген.
In fluorescence microscopy, colocalization refers to observation of the spatial overlap between two (or more) different fluorescent labels, each having a separate emission wavelength, to see if the different "targets" are located in the same area of the cell or very near to one another. The definition can be split into two different phenomena, co occurrence, which refers to the presence of two (possibly unrelated) fluorophores in the same pixel, and correlation, a much more significant statistical relationship between the fluorophores indicative of a biological interaction. along with other coefficients of which the "overlap coefficients" M1 and M2 have proved to be the most popular and useful. The purpose of using coefficients is to characterize the degree of overlap between images, usually two channels in a multidimensional microscopy image recorded at different emission wavelengths. A popular approach was introduced by Sylvain Costes, who utilized Pearson's correlation coefficient as a tool for setting the thresholds required by M1 and M2 in an objective fashion. Costes approach makes the assumption that only positive correlations are of interest, and does not provide a useful measurement of PCC. Although the use of coefficients can significantly improve the reliability of colocalization detection, it depends on the number of factors, including the conditions of how samples with fluorescence were prepared and how images with colocalization were acquired and processed. Studies should be conducted with great caution, and after careful background reading. Currently the field is dogged by confusion and a standardized approach is yet to be firmly established. Attempts to rectify this include re examination and revision of some of the coefficients, application of a factor to correct for noise, "Replicate based noise corrected correlations for accurate measurements of colocalization". and the proposal of further protocols, which were thoroughly reviewed by Bolte and Cordelieres (2006). Careful image restoration by deconvolution removes noise and increases contrast in images, improving the quality of colocalization analysis results. Up to now, most frequently used methods to quantify colocalization calculate the statistical correlation of pixel intensities in two distinct microscopy channels. More recent studies have shown that this can lead to high correlation coefficients even for targets that are known to reside in different cellular compartments. A more robust quantification of colocalization can be achieved by combining digital object recognition, the calculation of the area overlap and combination with a pixel intensity correlation value. This led to the concept of an object corrected Pearson's correlation coefficient. Various examples of quantification of colocalization in the field of neuroscience can be found in a review. Detailed protocols on the quantification of colocalization can be found in a book chapter.
Бір молекулалық ажырату
Колокализация – флуоресценттік белгіленген молекулалық түрлер арасындағы өзара әрекеттесуді анықтау үшін нақты уақыттағы бір молекулалық флуоресценттік микроскопияда қолданылады. Мұндай жағдайда, бір түр (мысалы, ДНҚ молекуласы) әдетте бейнелеу бетінде бекітіледі, ал екінші түр (мысалы, ДНҚ-ға байланысатын белок) ерітіндіге қосылады. Екі түр де спектральды ажыратылатын (>50 нм) бояулармен белгіленеді, мысалы, цианин 3 және цианин 5. Флуоресценциялық стимуляция әдетте толық ішкі шағылысу режимінде жүзеге асырылады, бұл жаппай ерітіндідегі молекулаларға қарағанда беттегі молекулалардың сигнал-шу қатынасын арттырады. Молекулалар бетте пайда болатын нүктелер ретінде нақты уақытта анықталады, ал олардың орналасқан жері нүктелік таралу функцияларын қолдану арқылы 10-20 нм дәлдікпен анықталады. Биомолекулалардың әдеттегі мөлшері 10 нм шамасында болғандықтан, бұл дәлдік молекулалық өзара әрекеттесуді анықтау үшін жеткілікті.
Colocalization is used in real time single molecule fluorescence microscopy to detect interactions between fluorescently labeled molecular species. In this case, one species (e. g. a DNA molecule) is typically immobilized on the imaging surface, and the other species (e. g. a DNA binding protein) is supplied to the solution. The two species are labeled with dyes of spectrally resolved (>50 nm) colors, e. g. cyanine 3 and cyanine 5. Fluorescence excitation is typically carried out in total internal reflection mode which increases the signal to noise ratio for the molecules at the surface with respect to the molecules in bulk solution. The molecules are detected as spots appearing on the surface in real time, and their locations are found to within 10 20 nm by fitting of point spread functions. Since typical sizes of biomolecules are on the order of 10 nm, this precision is usually sufficient for calling of molecular interactions
Нәтижелерді түсіндіру
Сапалық және сандық колокализация зерттеулерінің нәтижелерін дұрыс түсіндіру үшін, оларды сипаттау мақсатында колокализация коэффициенттерінің мәндерімен байланысты бес лингвистикалық айнымалыдан тұратын жиынтық қолдану ұсынылды, мысалы, өте әлсіз, әлсіз, орташа, күшті және өте күшті. Бұл тәсіл тұманды жүйелік модель және компьютерлік симуляцияны пайдалануға негізделген. Жаңа коэффициенттер енгізілген жағдайда, олардың мәндерін аталған жиынтыққа бейімдеуге болады.
For the purpose of better interpretation of the results of qualitative and quantitative colocalization studies, it was suggested to use a set of five linguistic variables tied to the values of colocalization coefficients, such as very weak, weak, moderate, strong, and very strong, for describing them. The approach is based on the use of the fuzzy system model and computer simulation. When new coefficients are introduced, their values can be fitted into the set.
Бағалау суреттері
Флуоресценттік микроскопиялық кескіндердегі колокализация дәрежесін Colocalization Benchmark Source арқылы, алдын ала анықталған колокализация шамалары бар жүктеуге арналған кескіндер жинағының тегін жиынтығын пайдаланып, тексеруге болады.
The degree of colocalization in fluorescence microscopy images can be validated using the Colocalization Benchmark Source, a free collection of downloadable image sets with pre defined values of colocalization.