Введение
В флуоресцентной микроскопии колокализация относится к наблюдению пространственного перекрытия между двумя (или более) различными флуоресцентными метками, каждая из которых имеет отдельную длину волны излучения, чтобы определить, расположены ли различные "мишени" в одной и той же области клетки или очень близко друг к другу. Это определение можно разделить на два различных явления: совместное присутствие, которое подразумевает наличие двух (возможно, не связанных) флюорофоров в одном и том же пикселе, и корреляция – гораздо более значимая статистическая взаимосвязь между флюорофорами, указывающая на биологическое взаимодействие. Наряду с другими коэффициентами, наибольшую популярность и полезность приобрели "коэффициенты перекрытия" M1 и M2. Цель использования коэффициентов – характеризовать степень перекрытия изображений, обычно двух каналов в многомерном микроскопическом изображении, полученном на разных длинах волн излучения. Популярный подход был предложен Сильвеном Костесом, который использовал коэффициент корреляции Пирсона для объективного определения пороговых значений, необходимых для M1 и M2. Подход Костеса основан на предположении, что представляют интерес только положительные корреляции, и не позволяет эффективно измерять коэффициент корреляции Пирсона (PCC). Хотя использование коэффициентов может значительно повысить надежность определения колокализации, оно зависит от множества факторов, включая условия подготовки флуоресцентных образцов, а также способы получения и обработки изображений с колокализацией. Исследования следует проводить с большой осторожностью и после тщательного изучения соответствующей литературы. В настоящее время в этой области наблюдается путаница, и единый стандартизированный подход еще не сформировался. Попытки решить эту проблему включают пересмотр и уточнение некоторых коэффициентов, применение поправочного фактора для устранения шума, "корреляции, скорректированные на основе шума реплик для точных измерений колокализации", а также разработку дополнительных протоколов, которые были тщательно проанализированы Болте и Корделиерс (2006). Тщательное восстановление изображения с помощью деконволюции позволяет уменьшить шум и повысить контрастность, улучшая качество результатов анализа колокализации. До настоящего времени наиболее часто используемые методы количественной оценки колокализации рассчитывают статистическую корреляцию интенсивностей пикселей в двух различных микроскопических каналах. Однако более поздние исследования показали, что это может приводить к высоким коэффициентам корреляции даже для мишеней, которые, как известно, находятся в разных клеточных компартментах. Более надежная количественная оценка колокализации может быть достигнута путем комбинирования цифрового распознавания объектов, расчета площади перекрытия и сочетания с корреляцией интенсивностей пикселей. Это привело к разработке концепции коэффициента корреляции Пирсона, скорректированного на объекты. Различные примеры количественной оценки колокализации в области нейробиологии можно найти в обзоре литературы. Подробные протоколы количественной оценки колокализации представлены в главе книги.
Резолюция одной молекулы
Колокализация используется в флуоресцентной микроскопии отдельных молекул в реальном времени для обнаружения взаимодействий между флуоресцентно мечеными молекулярными видами. В этом случае один вид (например, молекула ДНК) обычно иммобилизуется на поверхности визуализации, а другой вид (например, белок, связывающий ДНК) добавляется в раствор. Оба вида метятся красителями с разрешенными спектрально (>50 нм) цветами, например, цианином 3 и цианином 5. Флуоресцентное возбуждение обычно проводится в режиме полного внутреннего отражения, что повышает отношение сигнал/шум для молекул на поверхности по сравнению с молекулами в объеме раствора. Молекулы обнаруживаются как пятна, появляющиеся на поверхности в реальном времени, и их местоположение определяется с точностью до 10–20 нм путем аппроксимации функции рассеяния точки. Поскольку типичные размеры биомолекул составляют около 10 нм, этой точности обычно достаточно для регистрации молекулярных взаимодействий.
Интерпретация результатов
Для более точной интерпретации результатов качественных и количественных исследований колимитации было предложено использовать набор из пяти лингвистических переменных, привязанных к значениям коэффициентов колимитации, таких как «очень слабый», «слабый», «умеренный», «сильный» и «очень сильный», для их описания. Подход основан на использовании модели нечеткой системы и компьютерного моделирования. При появлении новых коэффициентов их значения могут быть адаптированы к этому набору.
Сравнительные изображения
Степень колокализации на изображениях флуоресцентной микроскопии может быть оценена с помощью Colocalization Benchmark Source – бесплатной коллекции загружаемых наборов изображений с заранее заданными значениями колокализации.