Зардап көргендердегі ДНК сараптамасы: Дифференциалдық экстракция әдісінің жетілдірілуі
Differential extraction
Жақындық экстракциясы: зорлау қылмыстарында құрбан мен күдіктінің ДНК-сын бөлек анықтауға мүмкіндік береді. Сперма ДНК-сы эпителий ДНК-сынан жақсы сақталады.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Кіріспе
Дифференциалдық экстракция (дифференциалдық лизис деп те аталады) – екі түрлі жасушаның ДНК-сын олардың құрамын араластырмай-ақ алу процесін білдіреді. Бұл әдісті қолданудың ең көп таралған түрі – жыныстық зорлық-зомбылық оқиғаларынан алынған вагинальді эпителий жасушалары мен сперматозоидтардан ДНК алу, құрбанның және күдіктінің ДНК профильдерін анықтау үшін. Оның сәттілігіне себеп – сперматозоидтар өз ДНК-сын гистондар емес, дисульфидтік байланыстар арқылы біріктірілген протаминдер арқылы жинақтайды. Протаминдер ДНК-ны сперматозоидтардан бөліп алады, сондықтан ол эпителий жасушаларынан алынған ДНК-ға қарағанда ДНК-ны алуға көбірек төзімді. Вагинальдық/ректальдық үлгіде сперматозоидтардың бар екені анықталғаннан кейін (әдетте бояу және жарық микроскопиясы арқылы), субъектінің эпителий жасушалары стандартты ДНК экстракциялау әдісімен, мысалы, фенол/хлороформ экстракциясы арқылы лизистеледі және олардың ДНК-сы қалыпты тәсілмен алынады. Эпителийлік ДНК ерітіндісінен алынып, сақталады, ал сперматозоидтың ДНК-сы протаминдерге байланысқан күйінде тұншықтырылады. Дифференциалдық экстракция ДНК-ны босату үшін протаминдердегі күкірт байланыстарын бұзатын дитиотреитол (DTT) сияқты химиялық затты пайдаланады. ДНК протаминдерден бөлінгеннен кейін, ол стандартты ДНК алу әдістеріне бейімделеді. Бұл бір үлгіден екі түрлі ДНК фракциясын жасайды: құрбанның және күдіктінің. Алайда, сипатталған әдісті жүзеге асыру қиын, себебі ол өте еңбекті қажет етеді және көп уақыт алады, нәтижесінде тексерілмеген зорлау жиынтықтары жиналады. АҚШ-та ғана шамамен 500 000 зорлау жиынтығы бар. Гринспун және авторлар роботтандырылған автоматтандыру арқылы үлгіні өңдеу тиімділігі мен өнімділігін арттырғанын хабарлады. Дегенмен, сот-медициналық зертханалар үшін төмен өнімділік үлгілерімен байланысты шығындарды іске асырудың қиын болуы мүмкін және оны ақтауға болмайды. Жақында жоғары сапалы ДНК лизаттарын алу үшін көп қадамды нуклеин қышқылы экстракциясы енгізілді. Өзін-өзі жабысатын мембрана аралас үлгілерден ДНК-ны кезеңдеп босатуға және бөлуге мүмкіндік береді. Спин-бағана жүйесінде іске асырылған ол эпителий, сілекей немесе қан сияқты сот-медициналық үлгілердің дифференциалдық экстракциясын қамтитын ДНК экстракциялау процедураларына өте қолайлы. Боялған үлгілерге де, гинекологиялық тампондарға да қарапайым және сенімді экстракция протоколдары дифференциалдық экстракциядағы жиі айтылатын қиындықтарды жеңеді (мысалы, бірнеше жуу кезеңдерінен кейін сперматозоидты жоғалту). Бұған қоса, буферді кезеңдеп бөлу арқасында дифференциалдық экстракция процесінің уақыты мен күш-жігеріне тұрарлық екендігі туралы алдын ала шешім қабылдау мүмкін. Сексуалдық зорлық-зомбылық оқиғасының үлгісінде сперманы анықтау үшін иммунологиялық алдын ала сынақ бірдей үлгіні пайдаланып жүргізілуі мүмкін.
Differential extraction (also known as differential lysis) refers to the process by which the DNA from two different types of cells can be extracted without mixing their contents. The most common application of this method is the extraction of DNA from vaginal epithelial cells and sperm cells from sexual assault cases in order to determine the DNA profiles of the victim and the perpetrator. Its success is based on the fact that sperm cells pack their DNA using protamines (rather than histones) which are held together by disulfide bonds. The protamines sequester DNA from spermatozoa, making it more resilient to DNA extraction than DNA from epithelial cells. After determining that sperm cells are present (typically through staining and light microscopy) in a vaginal/rectal sample, the subject's epithelial cells are lysed by a standard DNA extraction method, like a phenol/chloroform extraction and their DNA extracted through normal means. The epithelial DNA in solution is removed and saved, while the sperm cell's DNA precipitates with the attached protamines. Differential extraction uses a chemical called dithiothreitol (DTT) to disrupt the sulfur bonds in the protamines in order to release its DNA. Once the DNA is detached from the protamines, it is prone to standard DNA extraction methods. This creates two different DNA fractions from one sample, that of the victim and that of the perpetrator. However, the described method is difficult to carry out because it is both very labor intensive and time consuming, leading to a build up of untested rape kits. An estimated 500.000 rape kits alone in the US. Greenspoon et al. reported improvements in sample processing efficiency and throughput using robotic automation. However, associated costs for implementation in conjunction with low throughput quantities of samples may be impractical for forensic laboratories and cannot be justified. Recently a multistep nucleic acid extraction procedure was introduced to provide DNA lysates of highest quality. A self sealing membrane allows a stepwise release and separation of DNA from mixed specimens. Implemented in a spin column system, it is ideally suitable for DNA extraction procedures involving differential extraction of forensic samples such as epithelium, saliva or blood vs. sperms. Simple and reliable extraction protocols for both, stained samples as well as gynecological swabs, respectively, overcome the often claimed difficulties in differential extraction (e. g. losing a sperm pellet through several washing steps). Furthermore, an early qualified decision whether the process of a differential extraction is worth the time and efforts is possible due to gradual buffer separation. As an immunological pre test for semen in a sample of sexual assault can be carried out using the identical sample.
Жұмыс ағыны
Біріншіден, адам ақуыздарын, мысалы, адам семеногелин антигенін, қалау бойынша оқшаулап, иммунологиялық талдау арқылы адам спермасының болуын жылдам тексеруге болады. Егер бұл тест оң нәтиже көрсетсе, сол қылмыстық іс бойынша алынған үлгі одан әрі зерттеледі. Дифференциалды лизистің бірінші кезеңі әйел ДНК-сын алу үшін қалыпты жағдайларда жүргізіледі. Эпителий жасушаларының лизаты, тіпті қыздыру және орташа шайқау кезінде де бағананың ішінде тоқтатылады. Центрифугалаудан кейін, ерітінді бағана арқылы жинау түтігіне өтеді. ДНК лизаты одан әрі тазартылып, құрбанның аутосомалық STR профилін жасау үшін қолданылады. Кінәліні анықтауға қажетті еркек ДНК-ны алу үшін, сақталған сперматозоидтарды бұзу мақсатында, үлгіні тасымалдау қажеттілігі болмай, дәл сол сүзгі бағанасына күшті лизистік жағдайлар қолданылады. ДНК-ның жоғары мөлшеріне байланысты, келесі талдау арқылы ДНК профилін сәтті алу мүмкіндігі едәуір артады. Бұл қарапайым процедура уақытты үнемдеуге және қолмен атқарылатын процестің өнімділігін арттыруға, соның салдарынан қылмыстарды ашу деңгейін жоғарылатуға және жинақталған қылмыстық үлгілерді тездетіп зерттеуге мүмкіндік береді.
First of all human proteins, e. g. human semenogelin antigen, can be optional isolated and immunologically analyzed to quick check for the presence of human seminal fluid. If this test shows a positive result, the same casework sample will be processed further. The first part of the differential lysis is carried out under mild conditions to gain the female DNA. Lysate of the epithelia cells is retained within the column even during heat incubation and moderate shaking. Upon centrifugation, the solution passes the column into the collection tube. The DNA lysate is further purified and used to generate an autosomal STR profile of the victim. To further obtain the male DNA which will identify the perpetrator, harsher lysis conditions will be applied afterwards to the very same filter column without the necessity of sample carriage in order to break open the retained spermatozoa. Due to the high yield of DNA, the chance of a successful DNA profile by downstream analysis is significantly increased. This simple handling allows time savings and higher throughput in this manual process to improve crime solution rates and to speed up analysis of backlogged crime samples.