Введение

Дифференциальная экстракция (также известная как дифференциальный лиз) – это процесс, позволяющий извлекать ДНК из двух различных типов клеток, не смешивая их содержимое. Наиболее распространенным применением этого метода является извлечение ДНК из эпителиальных клеток влагалища и сперматозоидов при расследовании сексуальных преступлений для определения ДНК-профилей жертвы и нападавшего. Успех метода основан на том, что сперматозоиды упаковывают свою ДНК с помощью протоаминов (вместо гистонов), связанных дисульфидными связями. Протамины секвестрируют ДНК сперматозоидов, делая ее более устойчивой к экстракции, чем ДНК из эпителиальных клеток. После подтверждения наличия сперматозоидов (обычно путем окрашивания и световой микроскопии) в образце из влагалища/прямой кишки, эпителиальные клетки исследуемого лица лизируются стандартным методом экстракции ДНК, например, экстракцией фенолом/хлороформом, и их ДНК извлекается обычным способом. Эпителиальная ДНК в растворе удаляется и сохраняется, а ДНК сперматозоидов осаждается вместе с прикрепленными протоаминами. Дифференциальная экстракция использует химическое вещество дитиотреитол (DTT) для разрыва серных связей в протоаминах и высвобождения ДНК. После отделения ДНК от протоаминов она становится доступной для стандартных методов экстракции ДНК. Это позволяет получить две различные фракции ДНК из одного образца – ДНК жертвы и ДНК нападавшего. Однако описанный метод сложен в исполнении, поскольку требует значительных трудозатрат и времени, что приводит к накоплению неисследованных наборов для выявления изнасилования. По оценкам, только в США насчитывается около 500 000 таких наборов. Гринспун и соавторы сообщили об улучшении эффективности обработки образцов и увеличении пропускной способности за счет использования роботизированной автоматизации. Однако связанные с этим затраты на внедрение, в сочетании с небольшим количеством образцов, могут быть непрактичными для судебно-медицинских лабораторий и не могут быть оправданы. Недавно была разработана многоступенчатая процедура экстракции нуклеиновых кислот, обеспечивающая получение лизатов ДНК высочайшего качества. Самозакрывающаяся мембрана позволяет поэтапно высвобождать и разделять ДНК из смешанных образцов. Реализованная в системе спин-колонн, она идеально подходит для процедур экстракции ДНК, включающих дифференциальную экстракцию судебно-медицинских образцов, таких как эпителий, слюна или кровь по отношению к сперматозоидам. Простые и надежные протоколы экстракции как для окрашенных образцов, так и для гинекологических мазков позволяют преодолеть часто упоминаемые трудности дифференциальной экстракции (например, потерю гранул спермы при нескольких этапах промывки). Кроме того, благодаря постепенному разделению буферов возможно раннее и обоснованное решение о целесообразности проведения дифференциальной экстракции. Также, в качестве иммунологического предварительного теста на наличие спермы в образце, полученном при сексуальном насилии, можно использовать тот же самый образец.

Рабочий процесс

Прежде всего, человеческие белки, например, человеческий антиген спермогелина, могут быть опционально выделены и иммунологически проанализированы для быстрой проверки наличия человеческой семенной жидкости. Если этот тест показывает положительный результат, тот же образец из дела будет подвергнут дальнейшей обработке. Первая часть дифференциального лизиса проводится в мягких условиях для выделения женской ДНК. Лизат эпителиальных клеток удерживается в колонке даже во время нагревания и умеренного встряхивания. После центрифугирования раствор проходит через колонку в сборную трубку. Лизат ДНК затем очищается и используется для построения аутосомного STR-профиля жертвы. Для дальнейшего выделения мужской ДНК, необходимой для идентификации преступника, к той же самой фильтрующей колонке впоследствии будут применены более жесткие условия лизиса, без необходимости переноса образца, для разрушения удерживаемых сперматозоидов. Благодаря высокой концентрации ДНК значительно повышается вероятность успешного получения ДНК-профиля при последующем анализе. Такая простая процедура позволяет экономить время и увеличивать пропускную способность этого ручного процесса, что способствует повышению раскрываемости преступлений и ускорению анализа накопившихся образцов.