РНК праймерлік кеңейту әдісімен РНК транскрипциясының басталу орны анықталады. Радиоактивті праймер, обрат транскриптаза қолданылады. Молекулярлық биология.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Кіріспе
Праймерлік кеңею – РНК-ның 5' ұштарын картаға түсіруге мүмкіндік беретін әдіс, яғни оларды тізбектеп, дұрыс анықтауға болады. Праймерлік кеңею транскрипцияның басталу орнын анықтау үшін қолданылады (осы әдіспен аяқталу орнын анықтау мүмкін емес), егер оның тізбегі белгілі болса. Бұл әдіс үшін радиобелгіленген праймер қажет (әдетте 20-50 нуклеотид ұзындығында), ол мРНК-ның 3' ұшына жақын аймаққа толықтырылады. Праймерге РНК-мен байланысуға рұқсат етіледі, содан кейін кері транскриптаза РНК-дан cДНК синтездеу үшін қолданылады, ол РНК-ның 5' ұшына дейін жетеді. Гибридті денатұрациялау және кеңейтілген cDNA-ны электрофоретикалық гельде маркер ретінде пайдалану арқылы транскрипцияның басталу орнын анықтауға болады. Әдетте, бұл гельдегі орналасуын ДНК тізбектерімен (мысалы, Сэнгер тізбектеуі) салыстыру арқылы жасалады, мүмкіндігінше ДНК матрицалық жіптегі бірдей праймерді қолдана отырып. Транскрипцияның басталатын нақты нуклеотидін белгіленген кеңейтілген праймерді маркерлік нуклеотидпен салыстыру арқылы анықтауға болады, олар екеуі де гельдегі бірдей қашықтыққа ие. Праймерлік кеңею РНК транскрипттерін сандық және карталық түрде анықтау үшін нуклеаза қорғаныс әсерін анықтауға (S1 нуклеаза картасы) балама болып табылады. Праймерлік кеңею үшін гибридтеу зонды синтезделген олигонуклеотид болып табылады, ал S1 картасы үшін ДНК фрагментін бөліп алу қажет. Екі әдіс те мРНК қай жерден басталатыны туралы ақпарат береді және нәтижедегі авторадиограммадағы транскрипт жолағының қарқындылығы арқылы транскрипт концентрациясын бағалауға мүмкіндік береді. Алайда, S1 картасынан айырмашылығы, праймерлік кеңею тек мРНК транскриптінің 5' ұшын анықтау үшін қолданылуы мүмкін, себебі анализ үшін қажетті ДНК синтезі кері транскриптазаға негізделген (ол тек 5' → 3' бағытында полимерленеді). Праймерлік кеңею сплайс учаскелеріне әсер етпейді, сондықтан аралық сплайс учаскелері S1 картасына кедеріс келтіретін жағдайларда артықшылықты табады. Соңында, праймерлік кеңею S1 картасынан дәлірек, себебі S1 картасында қолданылатын S1 нуклеаза РНК-ДНК гибридінің ұштарын "қырып тастауға" немесе бір жіпті аймақтарды толыққанды деградацияламауға болады, бұл транскрипттің қысқа немесе ұзын көрінуіне әкеледі.
Primer extension is a technique whereby the 5' ends of RNA can be mapped that is, they can be sequenced and properly identified. Primer extension can be used to determine the start site of transcription (the end site cannot be determined by this method) by which its sequence is known. This technique requires a radiolabelled primer (usually 20 50 nucleotides in length) which is complementary to a region near the 3' end of the mRNA. The primer is allowed to anneal to the RNA and reverse transcriptase is used to synthesize cDNA from the RNA until it reaches the 5' end of the RNA. By denaturing the hybrid and using the extended primer cDNA as a marker on an electrophoretic gel, it is possible to determine the transcriptional start site. It is usually done so by comparing its location on the gel with the DNA sequence (e. g. Sanger sequencing), preferably by using the same primer on the DNA template strand. The exact nucleotide by which the transcription starts at can be pinpointed by matching the labelled extended primer with the marker nucleotide, who are both sharing the same migration distance on the gel. Primer extension offers an alternative to a nuclease protection assay (S1 nuclease mapping) for quantifying and mapping RNA transcripts. The hybridization probe for primer extension is a synthesized oligonucleotide, whereas S1 mapping requires isolation of a DNA fragment. Both methods provide information where a mRNA starts and provide an estimate of the concentration of a transcript by the intensity of the transcript band on the resulting autoradiograph. Unlike S1 mapping, however, primer extension can only be used to locate the 5’ end of an mRNA transcript because the DNA synthesis required for the assay relies on reverse transcriptase (only polymerizes in the 5’ → 3’ direction). Primer extension is unaffected by splice sites and is thus preferable in situations where intervening splice sites prevent S1 mapping. Finally, primer extension is more accurate than S1 mapping because the S1 nuclease used in S1 mapping can “nibble off” ends of the RNA DNA hybrid or fail to degrade the single stranded regions completely, making a transcript either appear shorter or longer.