Определение сайта начала транскрипции методом продления праймера.
Primer extension
Праймер-экстензия: определение сайта начала транскрипции РНК с помощью радиоактивного праймера и обратной транскриптазы. Метод в молекулярной биологии.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Введение
Расширение праймера – это метод, позволяющий картировать 5'-концы РНК, то есть секвенировать и точно идентифицировать их. Расширение праймера можно использовать для определения сайта начала транскрипции (конечный сайт этим методом определить нельзя), последовательность которого известна. Для этого метода требуется радиоактивно меченый праймер (обычно длиной 20–50 нуклеотидов), комплементарный области вблизи 3'-конца мРНК. Праймеру дают возможность аннеалировать к РНК, а затем обратная транскриптаза используется для синтеза кДНК из РНК до достижения 5'-конца РНК. Денатурируя гибрид и используя расширенный праймер-кДНК в качестве маркера на электрофоретическом геле, можно определить сайт начала транскрипции. Обычно это делается путем сравнения его положения на геле с последовательностью ДНК (например, секвенированием по Сэнгеру), предпочтительно с использованием того же праймера на матричной нити ДНК. Точный нуклеотид, с которого начинается транскрипция, можно определить, сопоставив меченый расширенный праймер с маркерным нуклеотидом, оба из которых имеют одинаковое расстояние миграции на геле. Расширение праймера является альтернативой анализу защиты нуклеазой (картированию с использованием нуклеазы S1) для количественного определения и картирования транскриптов РНК. Гибридизационный зонд для расширения праймера – это синтезированный олигонуклеотид, в то время как для картирования S1 требуется выделение фрагмента ДНК. Оба метода предоставляют информацию о начале мРНК и позволяют оценить концентрацию транскрипта по интенсивности полосы транскрипта на полученном авторадиографе. Однако, в отличие от картирования S1, расширение праймера можно использовать только для определения 5'-конца транскрипта мРНК, поскольку синтез ДНК, необходимый для анализа, зависит от обратной транскриптазы (которая полимеризует только в направлении 5' → 3'). Расширение праймера не подвержено влиянию сайтов сплайсинга и, следовательно, предпочтительнее в ситуациях, когда промежуточные сайты сплайсинга мешают картированию S1. Наконец, расширение праймера более точно, чем картирование S1, поскольку S1-нуклеаза, используемая в картировании S1, может "подтачивать" концы гибрида РНК-ДНК или не полностью деградировать одноцепочечные области, что приводит к тому, что транскрипт кажется либо короче, либо длиннее.
Primer extension is a technique whereby the 5' ends of RNA can be mapped that is, they can be sequenced and properly identified. Primer extension can be used to determine the start site of transcription (the end site cannot be determined by this method) by which its sequence is known. This technique requires a radiolabelled primer (usually 20 50 nucleotides in length) which is complementary to a region near the 3' end of the mRNA. The primer is allowed to anneal to the RNA and reverse transcriptase is used to synthesize cDNA from the RNA until it reaches the 5' end of the RNA. By denaturing the hybrid and using the extended primer cDNA as a marker on an electrophoretic gel, it is possible to determine the transcriptional start site. It is usually done so by comparing its location on the gel with the DNA sequence (e. g. Sanger sequencing), preferably by using the same primer on the DNA template strand. The exact nucleotide by which the transcription starts at can be pinpointed by matching the labelled extended primer with the marker nucleotide, who are both sharing the same migration distance on the gel. Primer extension offers an alternative to a nuclease protection assay (S1 nuclease mapping) for quantifying and mapping RNA transcripts. The hybridization probe for primer extension is a synthesized oligonucleotide, whereas S1 mapping requires isolation of a DNA fragment. Both methods provide information where a mRNA starts and provide an estimate of the concentration of a transcript by the intensity of the transcript band on the resulting autoradiograph. Unlike S1 mapping, however, primer extension can only be used to locate the 5’ end of an mRNA transcript because the DNA synthesis required for the assay relies on reverse transcriptase (only polymerizes in the 5’ → 3’ direction). Primer extension is unaffected by splice sites and is thus preferable in situations where intervening splice sites prevent S1 mapping. Finally, primer extension is more accurate than S1 mapping because the S1 nuclease used in S1 mapping can “nibble off” ends of the RNA DNA hybrid or fail to degrade the single stranded regions completely, making a transcript either appear shorter or longer.