Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
ДНҚ синтездеу әдісі
DNA synthesis technique
Ролингтік шеңберлік репликация (РШР) – плазмидтер, бактериофагтардың геномдары және вироидтардың шеңберлік РНК геномдары сияқты ДНК немесе РНК шеңберлік молекулаларының көптеген көшірмелерін жылдам синтездеуге мүмкіндік беретін, бір бағытты нуклеин қышқылының репликациясы процесі. Кейбір эукариоттық вирустар да өздерінің ДНК немесе РНК-сын ролингтік шеңбер механизмі арқылы көбейтеді. Табиғи ролингтік шеңберлік репликацияның қарапайымдалған нұсқасы ретінде, ДНК-ны изотермиялық күшейту техникасы – ролингтік шеңберлік күшейту әзірленді. РШР механизмі молекулалық биологияда және биомедициналық нанотехнологияда, әсіресе биосенсорлау (сигналды күшейту әдісі ретінде) саласында кеңінен қолданылады.
Rolling circle replication (RCR) is a process of unidirectional nucleic acid replication that can rapidly synthesize multiple copies of circular molecules of DNA or RNA, such as plasmids, the genomes of bacteriophages, and the circular RNA genome of viroids. Some eukaryotic viruses also replicate their DNA or RNA via the rolling circle mechanism. As a simplified version of natural rolling circle replication, an isothermal DNA amplification technique, rolling circle amplification was developed. The RCA mechanism is widely used in molecular biology and biomedical nanotechnology, especially in the field of biosensing (as a method of signal amplification).
Вирустың ДНК-ның репликациясы
Кейбір ДНҚ вирустары геномдық ақпаратын жаңашыр жасушаларда дөңгелек репликация арқылы көбейтіп жасайды. Мысалы, адам герпес вирусы 6 (HHV 6) (ХВВ) осы процеске қатысқан деп есептелетін «алғашқы гендер» жиынтығын өрнектейді. Соның нәтижесінде пайда болған ұзын конкатемерлер жеке вириондарға жиналғанда HHV 6 геномның pac 1 және pac 2 аймақтары арасында рибозималармен тілінеді. Адам папиллома вирусы 16 (АПВ 16) – ұрпақты жоғары жылдамдықпен өндіру үшін дөңгелек репликацияны қолданатын тағы бір вирус. HPV 16 адам эпителий жасушаларын жұқтырады және екі тізгілі дөңгелек геномға ие. Көбейту кезінде, бастапқыда, E1 гексамері бір тізгілі ДНҚ-ны орап, 3'-тен 5'-ке қарай қозғалады. Қалыпты екі бағытты репликацияда екі репликациялық белок соқтығысқанда ажырасады, бірақ HPV 16-да E1 гексамері ажыраспайды деп есептеледі, демек, үздіксіз дөңгелек репликацияға алып келеді. HPV-ның осы репликациялық механизмі вирустың жаңашыр хромосомасына енуіне және жатыр мойнының қатерлі ісігіне қарай дамуына физиологиялық әсер етуі мүмкін деп саналады. Сонымен қатар, geminivirus көбейту механизмі ретінде дөңгелек репликацияны пайдаланады. Бұл вирус көптеген маңызды егістіктерді, мысалы, макарон, мақта, бұршақ, жүгері, помидор және баклажанды жояды. Вирустың бір тізгілі дөңгелек ДНҚ-сы бар, ол жаңашыр өсімдік жасушаларында көбейеді. Бүкіл процесті geminivirus репликация инициаторы Rep атты белок бастайды, ол жаңашыр ортаны өзгертіп, репликация машинасының бір бөлігі ретінде жұмыс істеуіне жауапты. Rep эубактериялардың көптеген басқа репликация инициаторлық белоктарына өте ұқсас, оның N ұшында I, II және III мотивтері бар. Дөңгелек репликация кезінде geminivirus-тың бір тізгілі ДНҚ-сы екі тізгілі ДНҚ-ға айналады, содан кейін Rep бастапқы тізбек ТААТАТТАК-тағы екі тізгілі ДНҚ-ға байланысады. Rep және басқа репликациялық белоктар екі тізгілі ДНҚ-мен байланысқаннан кейін, ол сабақ тізбегін құрайды, онда ДНҚ наномер тізбегінде тілінеді, бұл тізгілінің ығысуына әкеледі. Бұл ығысу репликациялық жікпеңнің 3'-тен 5'-ке қарай өсуіне мүмкіндік береді, нәтижесінде жаңа бір тізгілі ДНҚ және конкатемерлік ДНҚ тізбегі пайда болады. Бактериофаг T4 ДНҚ репликациясының аралық құрамына дөңгелек және тармақталған дөңгелек конкатемерлік құрылымдар кіреді. Бұл құрылымдар, әдетте, репликацияның дөңгелек механизмін көрсетеді.
Some DNA viruses replicate their genomic information in host cells via rolling circle replication. For instance, human herpesvirus 6 (HHV 6)(hibv) expresses a set of "early genes" that are believed to be involved in this process. The long concatemers that result are subsequently cleaved between the pac 1 and pac 2 regions of HHV 6's genome by ribozymes when it is packaged into individual virions. Human Papillomavirus 16 (HPV 16) is another virus that employs rolling replication to produce progeny at a high rate. HPV 16 infects human epithelial cells and has a double stranded circular genome. During replication, at the origin, the E1 hexamer wraps around the single strand DNA and moves in the 3' to 5' direction. In normal bidirectional replication, the two replication proteins will disassociate at time of collision, but in HPV 16 it is believed that the E1 hexamer does not disassociate, hence leading to a continuous rolling replication. It is believed that this replication mechanism of HPV may have physiological implications into the integration of the virus into the host chromosome and eventual progression into cervical cancer. In addition, geminivirus also utilizes rolling circle replication as its replication mechanism. It is a virus that is responsible for destroying many major crops, such as cassava, cotton, legumes, maize, tomato and okra. The virus has a circular, single stranded, DNA that replicates in host plant cells. The entire process is initiated by the geminiviral replication initiator protein, Rep, which is also responsible for altering the host environment to act as part of the replication machinery. Rep is also strikingly similar to most other rolling replication initiator proteins of eubacteria, with the presence of motifs I, II, and III at is N terminus. During the rolling circle replication, the ssDNA of geminivirus is converted to dsDNA and Rep is then attached to the dsDNA at the origin sequence TAATATTAC. After Rep, along with other replication proteins, binds to the dsDNA it forms a stem loop where the DNA is then cleaved at the nanomer sequence causing a displacement of the strand. This displacement allows the replication fork to progress in the 3’ to 5’ direction which ultimately yields a new ssDNA strand and a concatameric DNA strand. Bacteriophage T4 DNA replication intermediates include circular and branched circular concatemeric structures. These structures likely reflect a rolling circle mechanism of replication.
Вирустық РНК репликациясы
Кейбір РНК вирустары мен вирусоидтар өз геномдарын айналмалы РНК репликациясы арқылы да көбейтіп жатады. Вирусоидтар үшін екі түрлі РНК репликация жолы бар, оларға сәйкес Pospivirodae (ассиметриялық репликация) және Avsunviroidae (симметриялық репликация) тұқымдарының мүшелері өтеді. Pospiviroidae (PSTVd сияқты) тұқымдарындағы шеңберлі плюс жіптік РНК иесінің РНК полимеразасымен олигомерлі минус жіптерге, содан кейін олигомерлі плюс жіптерге транскрипцияланады. Олигомерлі плюс жіптер иесінің RNase ферментімен тілінеді және иесінің РНК лигазасымен біріктіріліп, мономерлі плюс жіптік шеңберлі РНК-ны қайта құрайды. Бұл айналмалы репликацияның ассиметриялық жолы деп аталады. Avsunviroidae (ASBVd сияқты) тұқымдасына жататын вирусоидтар өз геномдарын айналмалы репликацияның симметриялық жолы арқылы көбейтеді. Бұл симметриялық жолда олигомерлі минус жіптер алдымен тілініп, мономерлі минус жіптерді құру үшін біріктіріледі, содан кейін олигомерлі плюс жіптерге транскрипцияланады. Олигомерлі плюс жіптер одан әрі тілініп, мономерлі плюс жіпті қайта құру үшін біріктіріледі. Симметриялық репликация жолы осылай аталған, себебі плюс және минус жіптер бірдей тәсілмен түзіледі. Олигомерлі плюс және минус жіптердің тілінуі Avsunviroidae-де кездесетін, бірақ Pospiviroidae-де жоқ, өзін-өзі тілетін молоточек рибозима құрылысымен қамтамасыз етіледі.
Some RNA viruses and viroids also replicate their genome through rolling circle RNA replication. For viroids, there are two alternative RNA replication pathways that respectively followed by members of the family Pospivirodae (asymmetric replication) and Avsunviroidae (symmetric replication). In the family Pospiviroidae (PSTVd like), the circular plus strand RNA is transcribed by a host RNA polymerase into oligomeric minus strands and then oligomeric plus strands. These oligomeric plus strands are cleaved by a host RNase and ligated by a host RNA ligase to reform the monomeric plus strand circular RNA. This is called the asymmetric pathway of rolling circle replication. The viroids in the family Avsunviroidae (ASBVd like) replicate their genome through the symmetric pathway of rolling circle replication. In this symmetric pathway, oligomeric minus strands are first cleaved and ligated to form monomeric minus strands, and then are transcribed into oligomeric plus strands. These oligomeric plus strands are then cleaved and ligated to reform the monomeric plus strand. The symmetric replication pathway was named because both plus and minus strands are produced the same way. Cleavage of the oligomeric plus and minus strands is mediated by the self cleaving hammerhead ribozyme structure present in the Avsunviroidae, but such structure is absent in the Pospiviroidae.
РҚҚ қолдану
RCA бір молекулалық байланысу оқиғасын мың еседен астам күшейте алады, бұл оны өте төмен мөлшердегі нысаналарды анықтау үшін ерекше пайдалы етеді. RCA реакцияларын ғана емес, сонымен қатар шыны, микро немесе нано бөлшектер, микроойыстар, микрофлюидты құрылғылар, тіпті қағаз жолақтары сияқты қатты беттерде де жүргізуге болады. Бұл мүмкіндік оны қатты фазалық иммуноталдауда (мысалы, ELISA) сигналдарды күшейту үшін өте қуатты құралға айналдырады. Осылайша, RCA геномика, протеомика, диагностика және биосенсорлық салаларда кең қолданылатын, сигналды күшейтудің өте әмбебап құралына айналуда.
RCA can amplify a single molecular binding event over a thousandfold, making it particularly useful for detecting targets with ultra low abundance. RCA reactions can be performed in not only free solution environments, but also on a solid surface like glass, micro or nano bead, microwell plates, microfluidic devices or even paper strips. This feature makes it a very powerful tool for amplifying signals in solid phase immunoassays (e. g., ELISA). In this way, RCA is becoming a highly versatile signal amplification tool with wide ranging applications in genomics, proteomics, diagnosis and biosensing.
Аптамерге негізделген иммуно- РСА
Антитело арқылы жүзеге асырылатын иммуно-RCA-дан өзге, ssDNA RCA праймерін ДНК аптамерінің 3' ұшына қосуға да болады. Праймердің тізбегін дөңгелек амплификация арқылы күшейтуге болады. Нәтижесін флуоресценттік маркермен белгілеп көруге болады. Бұл процестің схемасы оң жақтағы суретте көрсетілген.
In addition to antibody mediated immuno RCA, the ssDNA RCA primer can be conjugated to the 3' end of a DNA aptamer as well. The primer tail can be amplified through rolling circle amplification. The product can be visualized through the labeling of fluorescent reporter. The process is illustrated in the figure on the right.
RCA-ның басқа қолданбалары
РСА-ның әртүрлі туындылары биосенсорлық салада кеңінен қолданылды. Мысалы, РСА клиникалық үлгілерден вирустық және бактериялық ДНК-ны анықтау үшін табысты қолданылды, бұл жұқпалы ауруларды жылдам диагностикалау үшін өте пайдалы. Сонымен қатар, ол нуклеин қышқылының (ДНК және РНК) микромассивтік талдауы үшін чиптегі сигналды күшейту әдісі ретінде және наноаралдар құру үшін де қолданылды.
Various derivatives of RCA were widely used in the field of biosensing. For example, RCA has been successfully used for detecting the existence of viral and bacterial DNA from clinical samples, which is very beneficial for rapid diagnostics of infectious diseases. It has also been used as an on chip signal amplification method for nucleic acid (for both DNA and RNA) microarray assay. and formation of nano islands.