Жаңадан синтезделген РНК-ны анықтау: GRO-Seq әдісінің сипаттамасы

Кіріспе

Белгілі бір уақыт аралығында транскрипцияланатын гендерді анықтау үшін ядролық сынақ жүргізіледі. Шамамен бір миллион жасуша ядролары оқшауланып, таңбаланған нуклеотидтермен инкубацияланады, ал транскрипция процесіндегі гендер алынған РНК-ны блоттағы генге қатысты зондтарға гибридтеу арқылы анықталады. Гарсия Мартинес және авторлар (2004) ашытқы S. cerevisiae үшін (Genomic run on, GRO) протоколды әзірледі, ол барлық ашытқы гендерінің транскрипция жылдамдығын (ТР) есептеуге және барлық ашытқы мРНК-ларының тұрақтылығын бағалауға мүмкіндік береді. Жақында микроаррайлерге баламалы әдістер әзірленді, негізінен PolII RIP чипі: фосфорилирленген C терминалды доменге бағытталған антиденелермен РНК полимераза II-нің РНК иммунопреципитациясы және микроаррай слайдында немесе чипте гибридтеу (атауындағы «чип» сөзі «ChIP чиптен» шыққан, онда арнайы Affymetrix GeneChip қажет болды). Ашытқыда run on және ChIP чипіне негізделген әдістердің салыстыруы жасалды (Pelechano et al., 2009). Екі әдістің де сәйкес келетіні анықталды, бірақ GRO сезімталдығы және сандық көрсеткіштері жақсы. Run on тек созылатын РНК полимеразаларын анықтайтынын, ал ChIP чипі барлық РНК полимеразаларын, соның ішінде кері кеткендерін де анықтайтынын ескеру қажет. Саркозилдің қосылуымен жаңа РНК полимеразаның гендерге қосылуы тоқтатылады. Сондықтан, тек РНК полимеразасы бар гендер ғана таңбаланған транскрипттерді шығарады. Таңба қосылғанға дейін синтезделген РНК транскрипттері анықталмайды, себебі оларда таңба болмайды. Run on транскрипттерін таңбаны анықтайтын антиденелерді пайдаланып тазарту және осы оқшауланған транскрипттерді гендік экспрессия массивтерімен немесе жаңа буын секвенциялау (GRO Seq) арқылы гибридтеу арқылы да анықтауға болады. Run on сынақтары көбінесе келесі буын ДНК секвенциялауды оқу платформасы ретінде пайдаланатын Global Run on сынақтарымен алмастырылды. Бұл сынақтар GRO Seq деп аталады және транскрипцияға қатысатын гендердің сандық экспрессия деңгейімен егжей-тегжейлі көрінісін ұсынады. Global run on (GRO) сынақтарын талдауға арналған массивтік әдістер гендік тізбектерге қарсы зондтарды жоятын жаңа буын секвенциялаумен алмастырылуда. Секвенциялау тіпті дерекқорларда тіркелмеген транскрипттердің барлығын да тізімдейді. GRO seq жаңа синтезделген транскрипттерді бромуридинмен (BrU) таңбалауды қамтиды. Жасушалар немесе ядролар РНК полимеразаның ДНК-ға қосылуын болдырмайтын саркозилдің қатысуымен BrUTP-мен инкубацияланады. Сондықтан, саркозил қосылғанға дейін ДНК-да болған РНК полимераза ғана BrU таңбасымен таңбаланған жаңа транскрипттерді шығарады. Таңбаланған транскрипттер анти-BrU антиденесімен таңбаланған гранулалармен ұсталады, cDNA-ға түрлендіріледі, содан кейін жаңа буын ДНК секвенциялау арқылы секвенцияланады. Секвенциялау оқылымдары геноммен сәйкестендіріледі және транскрипт басына шаққандағы оқылымдар саны синтезделген транскрипттердің санын нақты бағалауға мүмкіндік береді.

A nuclear run on assay is conducted to identify the genes that are being transcribed at a certain time point. Approximately one million cell nuclei are isolated and incubated with labeled nucleotides, and genes in the process of being transcribed are detected by hybridization of extracted RNA to gene specific probes on a blot. Garcia Martinez et al. (2004) developed a protocol for the yeast S. cerevisiae (Genomic run on, GRO) that allows for the calculation of transcription rates (TRs) for all yeast genes to estimate mRNA stabilities for all yeast mRNAs. Alternative microarray methods have recently been developed, mainly PolII RIP chip: RNA immunoprecipitation of RNA polymerase II with phosphorylated C terminal domain directed antibodies and hybridization on a microarray slide or chip (the word chip in the name stems from "ChIP chip" where a special Affymetrix GeneChip was required). A comparison of methods based on run on and ChIP chip has been made in yeast (Pelechano et al., 2009). A general correspondence of both methods has been detected but GRO is more sensitive and quantitative. It has to be considered that run on only detects elongating RNA polymerases whereas ChIP chip detects all present RNA polymerases, including backtracked ones. Attachment of new RNA polymerase to genes is prevented by inclusion of sarkosyl. Therefore only genes that already have an RNA polymerase will produce labeled transcripts. RNA transcripts that were synthesized before the addition of the label will not be detected as they will lack the label. These run on transcripts can also be detected by purifying labeled transcripts by using antibodies that detect the label and hybridizing these isolated transcripts with gene expression arrays or by next generation sequencing (GRO Seq). Run on assays have been largely supplanted with Global Run on assays that use next generation DNA sequencing as a readout platform. These assays are known as GRO Seq and provide an incredibly detailed view of genes engaged in transcription with quantitative levels of expression. Array based methods for analyzing Global run on (GRO) assays are being replaced with Next Generation Sequencing which eliminates the design of probes against gene sequences. Sequencing will catalog all transcripts produced even if they are not reported in databases. GRO seq involves the labeling of newly synthesized transcripts with bromouridine (BrU). Cells or nuclei are incubated with BrUTP in the presence of sarkosyl, which prevents the attachment of RNA polymerase to the DNA. Therefore only RNA polymerase that are already on the DNA before the addition of sarkosyl will produce new transcripts that will be labeled with BrU. The labeled transcripts are captured with anti BrU antibody labeled beads, converted to cDNAs and then sequenced by Next Generation DNA sequencing. The sequencing reads are then aligned to the genome and number of reads per transcript provide an accurate estimate of the number of transcripts synthesized.