Анализ транскрипции: методы Run-on и GRO-seq

Введение

Для определения генов, которые транскрибируются в определенный момент времени, проводится анализ «run-on» в ядре. Примерно один миллион клеточных ядер изолируется и инкубируется с мечеными нуклеотидами, а гены, находящиеся в процессе транскрипции, обнаруживаются путем гибридизации выделенной РНК к ген-специфичным зондам на блоте. Гарсия Мартинес и др. (2004) разработали протокол для дрожжей *S. cerevisiae* (Genomic run-on, GRO), который позволяет рассчитывать скорости транскрипции (TR) для всех генов дрожжей и оценивать стабильность мРНК для всех мРНК дрожжей. Недавно были разработаны альтернативные методы на основе микромассивов, в основном PolII RIP-chip: иммунопреципитация РНК-полимеразы II с использованием антител, направленных на фосфорилированный C-концевой домен, и гибридизация на микромассивном слайде или чипе (слово «чип» в названии происходит от «ChIP-chip», где требовался специальный Affymetrix GeneChip). Сравнение методов, основанных на run-on и ChIP-chip, было проведено на дрожжах (Pelechano et al., 2009). Обнаружено общее соответствие между обоими методами, но GRO обладает большей чувствительностью и количественностью. Необходимо учитывать, что run-on обнаруживает только элонгирующие РНК-полимеразы, в то время как ChIP-chip обнаруживает все присутствующие РНК-полимеразы, включая возвращающиеся. Присоединение новых РНК-полимераз к генам предотвращается добавлением саркозила. Следовательно, только гены, которые уже связаны с РНК-полимеразой, будут производить меченые транскрипты. РНК-транскрипты, синтезированные до добавления метки, не будут обнаружены, поскольку они не будут мечеными. Эти run-on транскрипты также могут быть обнаружены путем очистки меченых транскриптов с использованием антител, распознающих метку, и гибридизации этих изолированных транскриптов с массивами экспрессии генов или секвенированием нового поколения (GRO-Seq). Анализы run-on в значительной степени были заменены глобальными анализами run-on (Global Run-on), использующими секвенирование ДНК нового поколения в качестве платформы для считывания. Эти анализы известны как GRO-Seq и обеспечивают невероятно детальный обзор генов, вовлеченных в транскрипцию, с количественными уровнями экспрессии. Методы на основе массивов для анализа глобальных run-on (GRO) анализов заменяются секвенированием нового поколения, что исключает необходимость в разработке зондов к генным последовательностям. Секвенирование каталогизирует все произведенные транскрипты, даже если они не представлены в базах данных. GRO-Seq включает мечение вновь синтезированных транскриптов бромуридином (BrU). Клетки или ядра инкубируются с BrUTP в присутствии саркозила, который предотвращает присоединение РНК-полимеразы к ДНК. Следовательно, только РНК-полимеразы, уже связанные с ДНК до добавления саркозила, будут производить новые транскрипты, которые будут мечены BrU. Меченые транскрипты захватываются анти-BrU антителами, иммобилизованными на гранулах, преобразуются в кДНК и затем секвенируются с помощью секвенирования ДНК нового поколения. Полученные последовательности выравниваются с геномом, и количество прочтений на транскрипт обеспечивает точную оценку количества синтезированных транскриптов.

A nuclear run on assay is conducted to identify the genes that are being transcribed at a certain time point. Approximately one million cell nuclei are isolated and incubated with labeled nucleotides, and genes in the process of being transcribed are detected by hybridization of extracted RNA to gene specific probes on a blot. Garcia Martinez et al. (2004) developed a protocol for the yeast S. cerevisiae (Genomic run on, GRO) that allows for the calculation of transcription rates (TRs) for all yeast genes to estimate mRNA stabilities for all yeast mRNAs. Alternative microarray methods have recently been developed, mainly PolII RIP chip: RNA immunoprecipitation of RNA polymerase II with phosphorylated C terminal domain directed antibodies and hybridization on a microarray slide or chip (the word chip in the name stems from "ChIP chip" where a special Affymetrix GeneChip was required). A comparison of methods based on run on and ChIP chip has been made in yeast (Pelechano et al., 2009). A general correspondence of both methods has been detected but GRO is more sensitive and quantitative. It has to be considered that run on only detects elongating RNA polymerases whereas ChIP chip detects all present RNA polymerases, including backtracked ones. Attachment of new RNA polymerase to genes is prevented by inclusion of sarkosyl. Therefore only genes that already have an RNA polymerase will produce labeled transcripts. RNA transcripts that were synthesized before the addition of the label will not be detected as they will lack the label. These run on transcripts can also be detected by purifying labeled transcripts by using antibodies that detect the label and hybridizing these isolated transcripts with gene expression arrays or by next generation sequencing (GRO Seq). Run on assays have been largely supplanted with Global Run on assays that use next generation DNA sequencing as a readout platform. These assays are known as GRO Seq and provide an incredibly detailed view of genes engaged in transcription with quantitative levels of expression. Array based methods for analyzing Global run on (GRO) assays are being replaced with Next Generation Sequencing which eliminates the design of probes against gene sequences. Sequencing will catalog all transcripts produced even if they are not reported in databases. GRO seq involves the labeling of newly synthesized transcripts with bromouridine (BrU). Cells or nuclei are incubated with BrUTP in the presence of sarkosyl, which prevents the attachment of RNA polymerase to the DNA. Therefore only RNA polymerase that are already on the DNA before the addition of sarkosyl will produce new transcripts that will be labeled with BrU. The labeled transcripts are captured with anti BrU antibody labeled beads, converted to cDNAs and then sequenced by Next Generation DNA sequencing. The sequencing reads are then aligned to the genome and number of reads per transcript provide an accurate estimate of the number of transcripts synthesized.