Введение
Силовая спектроскопия – это совокупность методов для изучения взаимодействий и сил связывания между отдельными молекулами. Эти методы позволяют измерять механические свойства отдельных полимерных молекул или белков, либо отдельных химических связей. Название "силовая спектроскопия", хотя и широко используется в научном сообществе, несколько обманчиво, поскольку не подразумевает взаимодействия материи с излучением. Методы, используемые для проведения силовой спектроскопии, включают атомно-силовую микроскопию, магнитные пинцеты, акустическую силовую спектроскопию, микроиглы и биомембраны. Силовая спектроскопия измеряет поведение молекулы под воздействием растягивающей или скручивающей механической силы. Благодаря этому в последние годы было получено много новых данных о механико-химической связи в ферментах, отвечающих за сокращение мышц, транспорт в клетке, генерацию энергии (F1-АТФаза), репликацию и транскрипцию ДНК (полимеразы), распутывание и раскручивание ДНК (топоизомеразы и геликазы). В отличие от традиционных ансамблевых спектроскопических методов, силовая спектроскопия позволяет исследователю определять свойства конкретной изучаемой молекулы. В частности, можно наблюдать редкие события, такие как изменения конформации, которые остаются незамеченными при анализе ансамбля молекул.
Экспериментальные методы
Есть много способов точного манипулирования отдельными молекулами. Среди наиболее известных – оптические или магнитные пинцеты, кантилеверы атомно-силового микроскопа (AFM) и акустическая силовая спектроскопия. Во всех этих методах биомолекула, такая как белок или ДНК, или иной биополимер, одним концом прикреплена к поверхности или микрометровой сфере, а другим – к датчику силы. Датчик силы обычно представляет собой микрометровую сферу или кантилевер, смещение которого измеряется для определения величины силы.
Спектроскопия акустических сил
Недавно разработанная методика, акустическая силовая спектроскопия (AFS), позволяет манипулировать силой сотен отдельных молекул и отдельных клеток параллельно, обеспечивая высокую экспериментальную пропускную способность. Вирусные белки также могут быть исследованы с помощью AFS; например, эта методика использовалась для изучения компактизации ДНК в сочетании с другими методами, работающими с отдельными молекулами. Клетки также можно манипулировать акустическими силами напрямую или используя микросферы в качестве захватов.
Пинцеты оптические
Другой метод, набирающий популярность в экспериментах с одиночными молекулами, – это использование оптических пинцетов для приложения механических сил к молекулам. Сильно сфокусированный лазерный луч способен захватывать и удерживать частицы (из диэлектрического материала) в диапазоне размеров от нанометров до микрометров. Удержание в оптических пинцетах обусловлено дипольным или оптическим градиентным воздействием на диэлектрическую сферу. Техника использования сфокусированного лазерного луча в качестве атомной ловушки была впервые применена в 1984 году в лабораториях Bell. До этого эксперименты проводились с использованием лазеров, направленных в противоположные стороны, для захвата частиц. Последующие эксперименты, в рамках того же проекта в Bell Labs и в других лабораториях, показали возможность манипулирования клетками без повреждений с помощью инфракрасного лазера. Таким образом, была заложена основа для биологических экспериментов с использованием оптической ловушки. Каждая техника имеет свои преимущества и недостатки. Например, кантилеверы атомно-силового микроскопа (AFM) могут измерять масштабы ангстрем, миллисекундные события и силы, превышающие 10 пН. В то время как стеклянные микроволокна не способны достичь такого высокого пространственного и временного разрешения, они могут измерять силы в пиконьютонах. Оптические пинцеты позволяют измерять силы в пиконьютонах и смещения в нанометрах, что является идеальным диапазоном для многих биологических экспериментов. Магнитные пинцеты могут измерять силы в фемтоньютонах, а также могут использоваться для приложения крутящего момента. Устройства AFS позволяют проводить статистический анализ механических свойств биологических систем, прикладывая силы в пиконьютонах к сотням отдельных частиц параллельно, с временем отклика менее миллисекунды.
Приложения
Общими применениями форс-спектроскопии являются измерения эластичности полимеров, особенно биополимеров, таких как РНК и ДНК. Другое биофизическое применение полимерной форс-спектроскопии – исследование разворачивания белков. Модульные белки могут адсорбироваться на золотой или (реже) слюдяной поверхности, а затем растягиваться. Последовательное разворачивание модулей наблюдается как очень характерный пилообразный рисунок на графике зависимости силы от удлинения; каждый зуб соответствует разворачиванию одного белкового модуля (за исключением последнего, который обычно соответствует отсоединению молекулы белка от кончика). С помощью этой техники можно получить значительную информацию об эластичности белков и их разворачивании. Многие белки в живой клетке подвергаются механическим напряжениям. Кроме того, форс-спектроскопия может быть использована для изучения ферментативной активности белков, участвующих в репликации, транскрипции, организации и репарации ДНК. Это достигается путем измерения положения бусины, прикрепленной к ДНК-белковому комплексу, остановленному на ДНК-ните, один конец которой закреплен на поверхности, при поддержании постоянной силы. Этот метод использовался, например, для изучения ингибирования элонгации транскрипции клебсидином и ацинетодином. Другим основным применением форс-спектроскопии является изучение механической прочности химических связей. В этом случае кончик обычно функционализирован лигандом, который связывается с другой молекулой, связанной с поверхностью. Кончик прижимается к поверхности, обеспечивая контакт между двумя молекулами, а затем оттягивается до тех пор, пока вновь образованная связь не разорвется. Измеряется сила, при которой происходит разрыв связи. Поскольку механический разрыв – это кинетический, стохастический процесс, сила разрыва не является абсолютным параметром, а зависит как от температуры, так и от скорости растяжения. Низкие температуры и высокие скорости растяжения соответствуют большей силе разрыва. Тщательный анализ силы разрыва при различных скоростях растяжения позволяет составить карту энергетического ландшафта химической связи под механическим воздействием. Это приводит к интересным результатам в изучении взаимодействия антиген-антитело, белок-белок, белок-живая клетка и «catch bonds». Недавно этот метод был использован в клеточной биологии для измерения агрегирующих стохастических сил, создаваемых моторными белками, которые влияют на движение частиц в цитоплазме. Таким образом, форс-спектроскопическая микроскопия может быть использована для лучшего понимания многих клеточных процессов, требующих движения частиц в цитоплазме.