ДНК көшірмесі және ДНК полимеразасы

Кіріспе

ДНК репликациясының түрі

ДНК полимеразасы – нуклеозид трифосфаттарынан, ДНК молекулалық прекурсорларынан ДНК молекулаларының синтезін катализдейтін ферменттер отбасының мүшесі. Бұл ферменттер ДНК репликациясы үшін маңызды және әдетте бір түпнұсқа ДНК дуплексінен екі бірдей ДНК дуплексін құру үшін топта жұмыс істейді. Осы процесте ДНК полимеразасы бар ДНК тізбектерін "оқып", оларға сәйкес екі жаңа тізбек жасайды. Бұл ферменттер дезоксинуклеозид трифосфат + DNAn → пирофосфат + DNAn+1 химиялық реакциясын катализдейді. ДНК полимеразасы бір мезгілде бір нуклеотидтен ДНК тізбегінің үштік (3') ұшына нуклеотидтерді қосады. Клетка бөлінген сайын ДНК полимеразалары клетканың ДНК-сын көшіруге қажет, осылайша бастапқы ДНК молекуласының көшірмесі әрбір жаңа клеткаға беріледі. Осылайша генетикалық ақпарат ұрпақтан ұрпаққа жалғасады. Репликация басталар алдында геликаза деп аталатын фермент ДНК молекуласын тығыз өрілген күйінен босатып, нуклеотидтік негіздер арасындағы сутекті байланыстарды үзеді. Бұл екі тізбекті ДНК-ны ашып, жоғарыда аталған реакцияда репликация үшін үлгі ретінде пайдаланылатын екі бір тізбекті ДНК-ны құрайды.

Тарих

1956 жылы Артур Корнберг және әріптестері Escherichia coli бактериясында ДНК полимераза I (Pol I) ашты. Олар ДНК полимеразасының үлгілік ДНК тізбегінің негіздерін көшіру арқылы ДНК репликациясы процесін сипаттады. Корнберг бұл жұмысы үшін 1959 жылы физиология және медицина саласындағы Нобель сыйлығымен марапатталды. ДНК полимераза II 1970 жылы Томас Корнберг (Артур Корнбергтің ұлы) және Малкольм Э. Гефтер Е. coli ДНК репликациясында Pol I-дің рөлін одан әрі зерттеу барысында тапты. Е. coli-де ДНК полимераза III (1970 жылдары ашылған) және ДНК полимераза IV және V (1999 жылы ашылған) қоса, тағы үш ДНК полимераза табылды.

Функция

ДНҚ полимеразаның негізгі қызметі – ДНҚ құрылыс блоктары – дезоксирибонуклеотидтерден ДНҚ синтездеу. ДНК көшірмелері түпнұсқа ДНК молекуласының әрбір жіпіндегі нуклеотидтер мен негіздердің жұптасуы арқылы жасалады. Бұл жұптасу әрқашан белгілі бір комбинацияларда жүзеге асады: цитозин гуанинмен, ал тимин аденинмен, сәйкесінше екі бөлек жұпты құрайды. Ал РНК полимеразалар РНК немесе ДНҚ-дан алынған рибонуклеотидтерден РНК синтездейді. Жаңа ДНК синтездегенде ДНҚ полимераза жаңадан пайда болған жіптің 3' ұшына ғана бос нуклеотидтерді қоса алады. Бұл жаңадан пайда болған жіптің 5'-3' бағытта ұзаруына әкеледі. Жаңадан пайда болған жіптің (қызыл жіп) бағыттылығы ДНК полимеразаның үлгі жіп бойымен қозғалатын бағытына қарама-қарсы екенін ескеру маңызды. ДНК полимераза синтезді бастау үшін бос 3'OH тобын қажет ететіндіктен, ол бұрыннан бар нуклеотидтік тізбектің 3' ұшын созып, тек бір бағытта ғана синтездей алады. Сондықтан ДНК полимераза 3'-5' бағытта шаблонды жіп бойымен қозғалады, ал қыз жіп 5'-3' бағытта қалыптасады. Бұл айырмашылық нәтижесінде пайда болған қос жіпті ДНК-ның бір-біріне антипараллель екі ДНК жібінен құралуына мүмкіндік береді. ДНК полимеразаның қызметі толыққанды емес, фермент көшірілген әрбір миллиард негіз жұбына шамамен бір қате жібереді. Қателерді түзету – кейбір, бірақ барлық емес ДНК полимеразалардың қасиеті. Бұл процесс жаңадан синтезделген ДНК-дағы қателерді түзетеді. Дұрыс емес негіз жұбы анықталса, ДНК полимераза бір негіз жұбына кері қозғалады. Ферменттің 3'-5' экзонуклеазалық белсенділігі дұрыс емес негіз жұбын алып тастауға мүмкіндік береді (бұл белсенділік корректура деп аталады). Негізді алып тастағаннан кейін полимераза дұрыс негізді қайтадан енгізе алады және репликация жалғаса береді. Бұл қыз жасушаларына берілетін бастапқы ДНК-ның тұтастығын сақтайды. ДНК репликациясында адалдық өте маңызды. ДНК негіздерінің жұптасуындағы сәйкессіздік дисфункционалды ақуыздардың пайда болуына және қатерлі ісікке әкелуі мүмкін. Көптеген ДНК полимеразаларында экзонуклеаза домені бар, ол негіз жұптарының сәйкессіздігін анықтап, дұрыс емес нуклеотидті дұрыс нуклеотидпен алмастыру үшін одан әрі жұмыс істейді. Уотсон мен Крик негіздерінің жұптасуындағы форма және өзара әрекеттесулер бірінші кезекте анықтауға немесе қателікке ықпал етеді. Сутекті байланыстар негіз жұптарының байланысуы мен өзара әрекеттесуінде маңызды рөл атқарады. Сәйкессіздік кезінде болатын өзара әрекеттесудің жоғалуы полимеразадан экзонуклеаза доменіне шаблон праймерінің байланысы үшін тепе-теңдіктің өзгеруіне әкеледі. Сонымен қатар, дұрыс емес нуклеотидтің қосылуы ДНК полимерлендіруді баяулатады. Бұл кешігу ДНК-ның полимеразалық орыннан экзонуклеазалық орынға ауысуына уақыт береді. Әр түрлі сәйкессіздіктерде әр түрлі конформациялық өзгерістер мен өзара әрекеттесудің жоғалуы болады. Пурин:пиримидин сәйкессіздігі кезінде пиримидин үлкен саңылауға қарай, ал пурин кіші саңылауға қарай ығысады. ДНК полимеразаның байланыстыру қалтасының пішініне байланысты, пурин мен қалдықтар арасында кішігірім саңылауда стериялық соқтығысулар пайда болады, ал пиримидин маңызды ван дер Ваальс және электростатикалық өзара әрекеттесулерді жоғалтады. Пиримидин:пиримидин және пурин:пурин сәйкессіздіктері негіздер негізгі саңылауға қарай ығысып кеткендіктен, айтарлықтай өзгерістерді білдірмейді және стерикалық кедергі аз болады. Алайда, әр түрлі сәйкессіздіктер әр түрлі стерикалық қасиеттерге әкелгенімен, ДНК полимераза оларды біркелкі түрде анықтап, ажыратып, ДНК репликациясында адалдықты сақтай алады. ДНК полимерлендіру көптеген мутагенез процестері үшін де маңызды және биотехнологияда кеңінен қолданылады.

The main function of DNA polymerase is to synthesize DNA from deoxyribonucleotides, the building blocks of DNA. The DNA copies are created by the pairing of nucleotides to bases present on each strand of the original DNA molecule. This pairing always occurs in specific combinations, with cytosine along with guanine, and thymine along with adenine, forming two separate pairs, respectively. By contrast, RNA polymerases synthesize RNA from ribonucleotides from either RNA or DNA. When synthesizing new DNA, DNA polymerase can add free nucleotides only to the 3' end of the newly forming strand. This results in elongation of the newly forming strand in a 5'–3' direction. It is important to note that the directionality of the newly forming strand (the daughter strand) is opposite to the direction in which DNA polymerase moves along the template strand. Since DNA polymerase requires a free 3' OH group for initiation of synthesis, it can synthesize in only one direction by extending the 3' end of the preexisting nucleotide chain. Hence, DNA polymerase moves along the template strand in a 3'–5' direction, and the daughter strand is formed in a 5'–3' direction. This difference enables the resultant double strand DNA formed to be composed of two DNA strands that are antiparallel to each other. The function of DNA polymerase is not quite perfect, with the enzyme making about one mistake for every billion base pairs copied. Error correction is a property of some, but not all DNA polymerases. This process corrects mistakes in newly synthesized DNA. When an incorrect base pair is recognized, DNA polymerase moves backwards by one base pair of DNA. The 3'–5' exonuclease activity of the enzyme allows the incorrect base pair to be excised (this activity is known as proofreading). Following base excision, the polymerase can re insert the correct base and replication can continue forwards. This preserves the integrity of the original DNA strand that is passed onto the daughter cells. Fidelity is very important in DNA replication. Mismatches in DNA base pairing can potentially result in dysfunctional proteins and could lead to cancer. Many DNA polymerases contain an exonuclease domain, which acts in detecting base pair mismatches and further performs in the removal of the incorrect nucleotide to be replaced by the correct one. The shape and the interactions accommodating the Watson and Crick base pair are what primarily contribute to the detection or error. Hydrogen bonds play a key role in base pair binding and interaction. The loss of an interaction, which occurs at a mismatch, is said to trigger a shift in the balance, for the binding of the template primer, from the polymerase, to the exonuclease domain. In addition, an incorporation of a wrong nucleotide causes a retard in DNA polymerization. This delay gives time for the DNA to be switched from the polymerase site to the exonuclease site. Different conformational changes and loss of interaction occur at different mismatches. In a purine:pyrimidine mismatch there is a displacement of the pyrimidine towards the major groove and the purine towards the minor groove. Relative to the shape of DNA polymerase's binding pocket, steric clashes occur between the purine and residues in the minor groove, and important van der Waals and electrostatic interactions are lost by the pyrimidine. Pyrimidine:pyrimidine and purine:purine mismatches present less notable changes since the bases are displaced towards the major groove, and less steric hindrance is experienced. However, although the different mismatches result in different steric properties, DNA polymerase is still able to detect and differentiate them so uniformly and maintain fidelity in DNA replication. DNA polymerization is also critical for many mutagenesis processes and is widely employed in biotechnologies.

Құрылымы

Белгілі ДНҚ полимеразалардың құрылымы жоғары сақталған, яғни олардың негізгі каталитикалық суббірліктері түрлер арасында, домендік құрылымдарына қарамастан, өте аз өзгеріске ұшырайды. Сақталған құрылымдар әдетте жасушаның маңызды, алмастырылмайтын функцияларын көрсетеді, олардың сақталуы эволюциялық артықшылықтарды қамтамасыз етеді. Пішінін саусақ, баспаушық және алақан домендері бар оң қолға ұқсатуға болады. Алақан домен фосфорилдік трансферт реакциясында фосфорил топтарының ауысуын катализдейді. Фермент белсенді болғанда ДНҚ алақанға байланысады. Бұл реакция екі металл ионының механизмі арқылы катализделгені есептеледі. Баспаушық домен нуклеозид трифосфаттарды шаблондық негізге байланыстыру үшін жұмыс істейді. Баспаушық домен ДНҚ процессивтілігі, транслокациясы және орналасуында маңызды рөл атқарады.

Процессиялық

ДНҚ полимеразаның процессивті табиғатының арқасында катализінің жоғары жылдамдығы. Процессивтілік – полимерлік субстраттарда жұмыс істейтін ферменттерге тән қасиет. ДНҚ полимераза жағдайында процессивтілік дәрежесі фермент шаблонға байланған сайын қосылатын нуклеотидтердің орташа санын көрсетеді. Көбінесе ДНҚ полимераза праймер/шаблон қосылысын іздеуге және оған байлануға шамамен бір секунд уақыт жұмсайды. Байланғаннан кейін, процессивті емес ДНҚ полимераза секундына бір нуклеотидтен нуклеотидтерді қосады. Ал процессивті ДНҚ полимеразалар секундына бірнеше нуклеотид қосып, ДНҚ синтезінің жылдамдығын едәуір арттырады. Процессивтілік дәрежесі ДНҚ синтезінің жылдамдығымен тікелей байланысты. Тірі жасушадағы ДНҚ синтезінің жылдамдығы алғаш рет фагпен жұққан E. coli бактериясындағы фагтың T4 ДНҚ-сының ұзарту жылдамдығы ретінде анықталды. 37°C температурада ДНҚ экспоненциалды өсу кезеңінде жылдамдық секундына 749 нуклеотидті құрады. ДНҚ полимеразаның ДНҚ шаблоны бойымен сырғу қабілеті процессивтілікті арттырады. Репликация шатырында процессивтілік күрт жоғарылайды. Бұл артуға ДНҚ полимеразаның «сырғақ ДНҚ қысқышы» деп аталатын ақуыздармен байланысы көмектеседі. Қысқыштар – сақина тәрізді бірнеше ақуыз суббөлімшелерінен тұрады. АТФ гидролизі арқасында «сырғақ ДНҚ қысқышын жүктеуші ақуыздар» класының ақуыздары ДНҚ қысқыштарының сақиналық құрылымын ашып, ДНҚ талшығына байлануына және одан босатылуына мүмкіндік береді. Ақуыз-ақуыз өзара әрекеттесуі қысқыш арқылы ДНҚ полимеразаның ДНҚ шаблонынан таралуына кедерес жасайды, соның нәтижесінде ферменттің бірдей праймер/шаблон қосылысына байлануын және репликацияны жалғастыруын қамтамасыз етеді.

Прокариоттық полимераза

Прокариоттық полимеразалар екі түрі бар: негізгі полимераза және голофермент. Негізгі полимераза ДНК-ны ДНК қалыпынан синтездейді, бірақ ол синтезді өзі бастай немесе дұрыс іске асыра алмайды. Голофермент синтезді дұрыс бастайды.

Полиция

Прокариоттық А полимеразалар отбасына ДНК полимераза I (Pol I) ферменті кіреді, ол polA генімен кодталған және прокариоттардың барлығында кездеседі. Бұл жөндеу полимеразасы 3'-5' және 5'-3' экзонуклеазалық активтілігімен, сондай-ақ лагг-таспа синтезі кезінде түзілген Оказаки фрагменттерін өңдеу арқылы экзициялық жөндеуге қатысады. Pol I – ең көп таралған полимераза, ол E. coli бактериясындағы полимераза активтілігінің >95% құрайды; алайда, Pol I жоқ жасушалар да табылды, бұл Pol I активтілігі басқа төрт полимеразамен алмастырылуы мүмкін екенін көрсетеді. Pol I секундына ~15-20 нуклеотид қосады, демек, оның процессивтігі төмен. Оның орнына, Pol I РНК праймері: ДНҚ матрицасының қосылған жерінен, репликацияның басталу нүктесінен (ори) нуклеотидтерді қосуды бастайды. Басталу нүктесінен шамамен 400 бп төмен қарай Pol III голоферменті құралып, жоғары процессивті жылдамдықпен және қасиеттерімен репликацияны өз қолына алады. Taq полимеразасы – бұл отбасының жылуға төзімді ферменті, оның түзету қабілеті жоқ.

ІІ-ші бөлім

ДНҚ полимераза II – polB генімен кодталған В полимеразалар тобына жататын бір түрі. Pol II 3'-5' экзонуклеаза белсенділігіне ие және ДНҚ жөндеуге, репликацияны қайта бастауға, зақымдануларды айналып өтуге қатысады, ал оның жасушадағы саны SOS индукциясы кезінде ~30-50 данадан ~200-300 данаға дейін артуы мүмкін. Pol II сонымен қатар Pol III-нің қосалқысы саналады, себебі ол голофермент ақуыздарымен өзара әрекеттесе алады және жоғары процессивтілікке ие болады. Pol II-нің басты рөлі – репликация шатырында полимераза белсенділігін бағыттау және тоқтап қалған Pol III-ге терминалдық қателіктерді айналып өтуге көмектесу деп есептеледі. Pfu ДНҚ полимеразасы – бұл отбасының гипертермофильді археон Pyrococcus furiosus-та табылған жылуға төзімді ферменті. Толық жіктеу археялардағы B отбасын B1, B2, B3 топтарына бөледі, ал B2 – псевдоферменттер тобы. Pfu B3 тобына жатады. Археяларда кездесетін басқа PolB-лер "Casposons" – Cas1-ге тәуелді транспозонның құрамында болады.

ІІІ полюс

ДНК полимераза III голоферменті – *E. coli* бактериясында ДНК репликациясына қатысатын негізгі фермент және C полимеразалар тұқымдасына жатады. Ол үш құраушыдан тұрады: pol III өзегі, бета-сырғанақ қысқышының процессивтілік факторы және қысқышты жүктеу кешені. Өзегі үш суббірліктен тұрады: α, полимераза активтілігінің орталығы, ɛ, экзонуклеотикалық түзетуші және θ, ол ɛ үшін тұрақтандырғыш ретінде әрекет етуі мүмкін. Бета-сырғанақ қысқышының процессивтілік факторы да екі дана болып келеді, әр өзектің үстіне орналасып, ДНК-ны қоршап тұратын қысқышты құрайды, бұл жоғары процессивтілікті қамтамасыз етеді. Үшінші құраушы – жеті суббірліктен (τ2γδδχψ) тұратын қысқыш жүктеу кешені. Ескі оқулықтағы «тромбон моделі» әр репликациялық шанышқыда (RF) негізгі ферменттің екі эквиваленті бар созу кешенін бейнелейді, әр тізбек үшін біреу – артта қалған және біреу – жетекші. Клеткалық флуоресценттік микроскопия жетекші тізбек синтезі толық үздіксіз болмауы мүмкін екенін көрсетті, ал Pol III* (яғни, α, ε, τ, δ және χ суббірліктерінен тұратын голофермент, бета-сырғанақ қысқышынсыз) белсенді RF-тан жоғары жиілікпен ажыратылады. Бұл зерттеулерде репликациялық шанышқының айналу жылдамдығы Pol III* үшін 10 секунд, β2-сырғанақ қысқышы үшін 47 секунд, ал DnaB геликазасы үшін 15 минутты құрады. Бұл DnaB геликазасының RF-та тұрақты байланыста болатынын және құзыретті голофермент үшін нуклеация орталығы ретінде қызмет ете алатынын көрсетеді. *In vitro* бір молекулалық зерттеулер көрсеткендей, Pol III* артық болған кезде RF айналудың жоғары жылдамдығына ие, бірақ концентрация шектеулі болғанда репликациялық шанышқылармен тұрақты байланыста қалады. Pol IV – Y отбасылық полимераза, ол *dinB* генімен кодталады және репликациялық шанышқыда тоқтап қалған полимеразалардың салдарынан туындаған SOS индукциясы арқылы қосылады. SOS индукциясы кезінде Pol IV өндірісі он есеге артады, ал осы кезеңдегі функцияларының бірі – Pol III голоферментінің процессивтілігіне бөгет қою. Бұл бақылау бекетін құрады, репликацияны тоқтатады және ДНК зақымдануларын тиісті жөндеу жолы арқылы жөндеуге уақыт береді. Pol IV-тің тағы бір функциясы – тоқтап қалған репликациялық шанышқыда транслезиялық синтезді жүзеге асыру, мысалы, N2 дезоксигуанин аддукттарын зақымдалмаған ДНК-ны кесіп өтуге қарағанда жылдам айналып өту. *dinB* генін жоқ организмдерде ДНК-ны зақымдайтын факторлардың әсерінен мутагенездің деңгейі жоғары.

DNA polymerase III holoenzyme is the primary enzyme involved in DNA replication in E. coli and belongs to family C polymerases. It consists of three assemblies: the pol III core, the beta sliding clamp processivity factor, and the clamp loading complex. The core consists of three subunits: α, the polymerase activity hub, ɛ, exonucleolytic proofreader, and θ, which may act as a stabilizer for ɛ. The beta sliding clamp processivity factor is also present in duplicate, one for each core, to create a clamp that encloses DNA allowing for high processivity. The third assembly is a seven subunit (τ2γδδχψ) clamp loader complex. The old textbook "trombone model" depicts an elongation complex with two equivalents of the core enzyme at each replication fork (RF), one for each strand, the lagging and leading. In cell fluorescent microscopy has revealed that leading strand synthesis may not be completely continuous, and Pol III* (i. e., the holoenzyme α, ε, τ, δ and χ subunits without the ß2 sliding clamp) has a high frequency of dissociation from active RFs. In these studies, the replication fork turnover rate was about 10s for Pol III*, 47s for the ß2 sliding clamp, and 15m for the DnaB helicase. This suggests that the DnaB helicase may remain stably associated at RFs and serve as a nucleation point for the competent holoenzyme. In vitro single molecule studies have shown that Pol III* has a high rate of RF turnover when in excess, but remains stably associated with replication forks when concentration is limiting. Pol IV is a Family Y polymerase expressed by the dinB gene that is switched on via SOS induction caused by stalled polymerases at the replication fork. During SOS induction, Pol IV production is increased tenfold and one of the functions during this time is to interfere with Pol III holoenzyme processivity. This creates a checkpoint, stops replication, and allows time to repair DNA lesions via the appropriate repair pathway. Another function of Pol IV is to perform translesion synthesis at the stalled replication fork like, for example, bypassing N2 deoxyguanine adducts at a faster rate than transversing undamaged DNA. Cells lacking the dinB gene have a higher rate of mutagenesis caused by DNA damaging agents.

Pol V

ДНК полимераза V (Pol V) – Y отбасылық ДНК полимераза, ол SOS жауабы және транслезиялық синтез ДНК жөндеу механизмдеріне қатысады. Pol V-нің umuDC гендері арқылы транскрипциясы жоғары реттелген, сондықтан жасушада зақымдалған ДНК болған кезде және SOS жауабы туындағанда ғана Pol V өндіріледі. Полимеразалардың тоқтауы RecA-ның ssDNA-мен байланысуына себеп болады, бұл LexA ақуызының өзін-өзі ыдыратуына (autodigest) әкеледі. Содан кейін LexA umuDC оперонының транскрипциясын басу қабілетін жоғалтады. Осы RecA ssDNA нуклеопротеіні UmuD ақуызын UmuD' ақуызына посттрансляциялық түрлендіреді. UmuD және UmuD' UmuC-пен өзара әрекеттесетін гетеродимер құрайды, ол өз кезегінде зақымдалған ДНК-да umuC-нің полимеразалық каталитикалық белсенділігін белсендіреді. E. coli-де полимеразаның "құрал белдігі" моделі ұсынылған, онда pol III-ті pol IV-ке ауыстыру кезінде екі полимераза да бір мезгілде β-қысқышқа (β clamp) байланысады. Дегенмен, E. coli-де бірден көп TLS полимеразаның тізбектеп жұмыс істеп, зақымдалуды (lesion) айналып өтуі әлі көрсетілген жоқ. Сонымен қатар, Pol IV жоғары тиімділікпен инсерциялау және кеңейту реакцияларын катализдей алады, ал pol V негізгі SOS TLS полимеразасы болып саналады. Мысалы, ішкі тізбектегі гуанин-тимин байланысының айналып өтілуі кезінде екі полимеразаның мутациялық іздерінің айырмашылығы негізінде pol IV және pol V ішкі тізбектегі байланыстың TLS үшін бәсекелесетіндігі көрсетілді. 1998 жылы Д ДНК полимераза отбасы Pyrococcus furiosus және Methanococcus jannaschii түрлерінде ашылды. PolD кешені екі тізбектен тұратын гетеродимер болып табылады, олардың әрқайсысы DP1 (кішкентай түзетуші) және DP2 (ірі каталитикалық) гендерімен кодталған. Басқа ДНК полимеразалардан айырмашылығы, DP2 каталитикалық ядросының құрылымы мен механизмі көп суббөлімді РНК полимеразаларына ұқсас. DP1-DP2 интерфейсі эукариоттық B класындағы полимеразаның цинк саусағына және оның кішкентай суббөліміне ұқсас. Бұл Pol α және ε полимеразаларының кішкентай суббөлімінің алға батушысы болуы мүмкін, олар эукариоттарда жоғалған түзету қабілеттерін қамтамасыз етеді. Оның N-терминалды HSH домені құрылымы бойынша AAA протеиндеріне, әсіресе Pol III δ және RuvB суббөлімдеріне ұқсас. DP2 II класты KH доменіне ие. D ДНК полимераза отбасының алғашқы клеткалық организмдерде пайда болғаны және соңғы әмбебап клеткалық ата-бабаның (LUCA) репликациялық полимеразасы D отбасына жатқаны болжануда.

DNA polymerase V (Pol V) is a Y family DNA polymerase that is involved in SOS response and translesion synthesis DNA repair mechanisms. Transcription of Pol V via the umuDC genes is highly regulated to produce only Pol V when damaged DNA is present in the cell generating an SOS response. Stalled polymerases causes RecA to bind to the ssDNA, which causes the LexA protein to autodigest. LexA then loses its ability to repress the transcription of the umuDC operon. The same RecA ssDNA nucleoprotein posttranslationally modifies the UmuD protein into UmuD' protein. UmuD and UmuD' form a heterodimer that interacts with UmuC, which in turn activates umuC's polymerase catalytic activity on damaged DNA. In E. coli, a polymerase "tool belt" model for switching pol III with pol IV at a stalled replication fork, where both polymerases bind simultaneously to the β clamp, has been proposed. However, the involvement of more than one TLS polymerase working in succession to bypass a lesion has not yet been shown in E. coli. Moreover, Pol IV can catalyze both insertion and extension with high efficiency, whereas pol V is considered the major SOS TLS polymerase. One example is the bypass of intra strand guanine thymine cross link where it was shown on the basis of the difference in the mutational signatures of the two polymerases, that pol IV and pol V compete for TLS of the intra strand crosslink.]] In 1998, the family D of DNA polymerase was discovered in Pyrococcus furiosus and Methanococcus jannaschii. The PolD complex is a heterodimer of two chains, each encoded by DP1 (small proofreading) and DP2 (large catalytic). Unlike other DNA polymerases, the structure and mechanism of the DP2 catalytic core resemble that of multi subunit RNA polymerases. The DP1 DP2 interface resembles that of Eukaryotic Class B polymerase zinc finger and its small subunit. is likely the precursor of small subunit of Pol α and ε, providing proofreading capabilities now lost in Eukaryotes. Its N terminal HSH domain is similar to AAA proteins, especially Pol III subunit δ and RuvB, in structure. DP2 has a Class II KH domain. It has been proposed that family D DNA polymerase was the first to evolve in cellular organisms and that the replicative polymerase of the Last Universal Cellular Ancestor (LUCA) belonged to family D.

β, λ, σ, μ полимеразалары (бета, ламбда, сигма, му) және TdT

X полимеразалар туысына белгілі эукариоттық полимераза pol β (бета), сондай-ақ Pol σ (сигма), Pol λ (ламбда), Pol μ (му) және Терминалды дезоксинуклеотидил трансфераза (TdT) сияқты басқа эукариоттық полимеразалар кіреді. X полимеразалар туысы негізінен омыртқалы жануарларда кездеседі, ал кейбіреулері өсімдіктер мен саңырауқұлақтарда табылған. Бұл полимеразалардың жоғары сақталған аймақтары бар, олар ДНК полимераза өзара әрекеттесулері үшін маңызды екі спираль-шашты тігіс спиральді мотивтерді қамтиды. Бір мотив төменгі ағыстағы ДНҚ-мен өзара әрекеттесетін 8 кДа доменде, ал екінші мотив праймерлік тізбекпен өзара әрекеттесетін бас бармақ доменінде орналасқан. POLB генімен кодталған Pol β, алкилденген немесе тотыққан базаларды, сондай-ақ базалық орындарды жөндеуге қажетті қысқа жамаулы базалық экзиция жөндеуіне қатысады – бұл ДНК жөндеу жолы. POLL және POLM гендерімен кодталған Pol λ және Pol μ тиісінше гомолог емес ұштардың қосылуына қатысады, бұл сутек пероксиді және иондаушы сәулеленудің салдарынан ДНК-ның екі тізбегінің үзілуін қайта біріктіру механизмі. TdT тек лимфоидты тіндерде ғана экспрессияланады және V(D)J рекомбинациясы кезінде пайда болатын екі тізбектің үзілуіне "n нуклеотидтерін" қосып, иммундық әртүрлілікті арттырады.

α, δ және ε полимеразалары (альфа, дельта және эпсилон)

Pol α (альфа), Pol δ (дельта) және Pol ε (эпсилон) – B полимеразалар отбасының мүшелері және ядролық ДНҚ көшірмесіне (репликациясына) қатысатын негізгі полимеразалар. Pol α кешені (pol α ДНК примаза кешені) төрт субұрымнан тұрады: каталитикалық субұрым POLA1, реттеуші субұрым POLA2, және кішкентай және үлкен примаза субұрымдары PRIM1 және PRIM2. Примаза РНК праймерін жасағаннан кейін, Pol α ~20 нуклеотидпен праймерді ұзарту арқылы көшірме жасауды бастайды. Жоғары процессивтілігінің арқасында Pol δ жетекші және артта қалған тізбектің синтезін Pol α-дан қабылдайды. Pol ε POLE1, каталитикалық субұрым, POLE2 және POLE3 гендерімен кодталады. Pol ε функциясы көшірме жасау кезінде жетекші тізбекті ұзарту болып табылады, ал Pol δ негізінен артта қалған тізбекті көшіреді; алайда, соңғы деректер Pol δ-ның ДНҚ-ның жетекші тізбегін көшіруге де қатысуы мүмкін екенін көрсетеді. Полимераза активтілігі үшін қажет болмаса да, Pol ε-нің C-ұшындағы "полимераза реликт" аймағы, Pol ε-де PCNA-ға тәуелсіз жоғары процессивтілікті қамтамасыз ететін үлкен "ладонь" домені бар. Басқа B отбасы полимеразаларымен салыстырғанда, Pol α-да түзетуге (коррекцияға) жауапты DEDD экзонуклеазалар отбасы белсенді емес.

η, ι және κ полимеразалары (eta, iota және kappa)

Pol η (эта), Pol ι (йота) және Pol κ (каппа) – Y отбасылық ДНК полимеразалары, олар трансляциялық синтез арқылы ДНҚ жөндеуге қатысады және тиісінше POLH, POLI және POLK гендерімен кодталады. Y отбасы мүшелері субстрат пен праймердің ұшын байланыстыруға көмектесетін бес ортақ мотивке ие, және олардың барлығына кішкентай саусақ (LF), полимеразамен байланысты домен (PAD) немесе білезік сияқты қосымша домендері бар, сондай-ақ әдеттегі оң қолдың бас бармағы, алақаны және саусақ домендерін қамтиды. Дегенмен, активті орын отбасы мүшелері арасында әртүрлі зақымдануларды жөндеуге байланысты өзгеше болады. Y отбасының полимеразалары төмен дәлдікті полимеразалар болып табылады, бірақ полимеразаға әсер ететін мутациялар тері қатерлі ісігі және Xeroderma Pigmentosum Variant (XPS) сияқты түрлі ауруларды тудыруы мүмкін екені дәлелденген. Бұл полимеразалардың маңыздылығы ДНК полимеразасын кодтайтын η генінің XPV деп аталуынан көрінеді, себебі осы геннің жоғалуы Xeroderma Pigmentosum Variant ауруына алып келеді. Pol η ультракүлгін сәулеленуден туындаған ДНК зақымдануының дәл транслезиялық синтезі үшін ерекше маңызды. Pol κ-ның функционалдығы толыққанды түсініксіз, бірақ зерттеушілер екі ықтимал функцияны анықтады. Pol κ белгілі бір ДНК зақымдануларында нақты негізді кеңейтуші немесе енгізуші ретінде әрекет етеді деп саналады. Rev1 және барлық үш транслезиялық синтез полимеразалары тоқтап қалған репликациялық ДНК полимеразалары арқылы зақымдалған орындарға тартылады. Зақымды жөндеудің екі жолы бар, бұл зерттеушілерді таңдалған жолдың зақымдалған тізбекке, жетекші немесе қалыптасушы тізбекке байланысты екендігіне сендіреді.

Rev1 және ζ (зета) полимеразалары

Полимераза ζ – B отбасы полимеразасының тағы бір түрі, ол екі суббірліктен тұрады: Rev3, каталитикалық суббірлік, және Rev7 (MAD2L2), ол полимеразаның каталитикалық функциясын күшейтеді және транслезиялық синтезге қатысады. Полимераза ζ-ның 3'-ден 5'-ге дейінгі экзонуклеазалық активтілігі жоқ, және ол терминалдық қатестіктері бар праймерлерді ұзарта алатынымен ерекшеленеді. Rev1 үш қызығушылық аймағына ие: BRCT доменінде, убиквитин байланыстыру доменінде және C-терминалды доменінде, сондай-ақ dCMP трансферазалық қабілетіне ие, ол репликациялық полимеразалар Pol δ және Pol ε тоқтатып тастайтын зақымдалған орындарға қарсы дезоксицитидин қосады. Бұл тоқтаған полимеразалар өз кезегінде репликациялық полимеразаларды бөліп, Pol ζ және Rev1-ді тартатын убиквитин кешендерін белсендіреді. Бірлесіп, Pol ζ және Rev1 дезоксицитидин қосады, ал Pol ζ зақымдалған орыннан өтеді. Әлі анықталмаған процесс арқылы Pol ζ диссоциацияланады, ал репликациялық полимеразалар қайтадан бірігіп, репликацияны жалғастырады. Pol ζ және Rev1 репликация үшін қажет емес, бірақ бүршікленетін саңырауқұлақтағы REV3 генінің жоғалуы репликациялық полимеразалар тоқтаған репликациялық шанышқылардың күйреуіне байланысты ДНК-ға зиян келтіретін факторларға сезімталдықты арттыруы мүмкін.

Теломераза

Теломераза – сызықтық хромосомалардың ұштарын көбейтуге қатысатын рибонуклеопротеин, себебі қалыпты ДНК полимеразасы ұштарды немесе теломерлерді көбейте алмайды. 5’ TTAGGG 3’ тізбегі бар екі тізбекті хромосоманың 3’ бір тізбегі теломеразаны тартады. Теломераза басқа ДНК полимеразалар сияқты 3’ ұшын ұзарту арқылы әрекет етеді, бірақ басқа ДНК полимеразаларынан айырмашылығы, теломеразаға матрица қажет емес. Терс транскриптазаның мысалы – TERT суббірлігі, РНК суббірлігін қолданып, теломеразаның хромосома ұштарын 3’ бағытта ұзартуына мүмкіндік беретін праймер-матрицалық байланысын құрайды. Теломерлердің өмір бойы көптеген көбейістер нәтижесінде біртіндеп қысқаруы қартаю әсерлерімен байланысты деп саналады. Pol γ-ның жұмыс істемейтін немесе шектеулі жұмыс істейтін кез келген мутациясы мтДНК-ға елеулі әсер етеді және аутосомдық мұрагерлік митохондриялық аурулардың ең көп таралған себебі болып табылады. Pol γ құрамында С-ұшындағы полимераза домені және N-ұшындағы 3’–5’ экзонуклеаза домені бар, олар қосымша суббірлікті байланыстыратын линкер аймағы арқылы байланысқан. Қосымша суббірлік ДНК-ға байланысады және Pol γ процессивиті үшін қажет. Линкер аймағындағы A467T нүктелік мутациясы Pol γ-мен байланысты митохондриялық бұзылыстардың үштен бірінен астамына жауап береді. POLQ генімен кодталған Pol θ-ның көптеген гомологтары эукариоттарда кездеседі, бірақ оның функциясы толыққанды түсініксіз. С-ұшындағы аминоқышқылдар тізбегі Pol θ-ны А отбасы полимеразалары ретінде жіктесе де, Pol θ қателік деңгейі Y отбасы полимеразаларымен тығыз байланысты. Pol θ сәйкес келмейтін праймер ұштарын ұзартады және нуклеотид қосу арқылы абазиялық орындарды айналып өте алады. Сонымен қатар, полимераза доменінде дезоксирибофосфодиэстераза (dRPase) активтілігі бар және ssДНК жанында АТФаза активтілігін көрсете алады. Pol ν (ну) полимераза ферменттерінің ең тиімсізі саналады. Алайда, ДНК полимеразасы nu жасушалық жауаптар кезінде кросс-байланыстарға белсенді қатысады және геликазамен кешенде өзінің қызметін атқарады.

Telomerase is a ribonucleoprotein which functions to replicate ends of linear chromosomes since normal DNA polymerase cannot replicate the ends, or telomeres. The single strand 3' overhang of the double strand chromosome with the sequence 5' TTAGGG 3' recruits telomerase. Telomerase acts like other DNA polymerases by extending the 3' end, but, unlike other DNA polymerases, telomerase does not require a template. The TERT subunit, an example of a reverse transcriptase, uses the RNA subunit to form the primer–template junction that allows telomerase to extend the 3' end of chromosome ends. The gradual decrease in size of telomeres as the result of many replications over a lifetime are thought to be associated with the effects of aging. Any mutation that leads to limited or non functioning Pol γ has a significant effect on mtDNA and is the most common cause of autosomal inherited mitochondrial disorders. Pol γ contains a C terminus polymerase domain and an N terminus 3'–5' exonuclease domain that are connected via the linker region, which binds the accessory subunit. The accessory subunit binds DNA and is required for processivity of Pol γ. Point mutation A467T in the linker region is responsible for more than one third of all Pol γ associated mitochondrial disorders. While many homologs of Pol θ, encoded by the POLQ gene, are found in eukaryotes, its function is not clearly understood. The sequence of amino acids in the C terminus is what classifies Pol θ as Family A polymerase, although the error rate for Pol θ is more closely related to Family Y polymerases. Pol θ extends mismatched primer termini and can bypass abasic sites by adding a nucleotide. It also has Deoxyribophosphodiesterase (dRPase) activity in the polymerase domain and can show ATPase activity in close proximity to ssDNA. Pol ν (nu) is considered to be the least effective of the polymerase enzymes. However, DNA polymerase nu plays an active role in homology repair during cellular responses to crosslinks, fulfilling its role in a complex with helicase.

Кері транскриптаза

Ретровирустар РНК үлгісінен ДНК-ны синтездейтін РНК-ға тәуелді ДНК-полимераза (RdDp) болып табылатын ерекше кері транскриптазаны кодтайды. Кері транскриптаза отбасы ДНК полимераза және РНҚ-ға жұптасқан РНК негізін ыдырататын РНҚаза H функцияларын қамтиды. Ретровирустың мысалы – АИТВ. Жұққаннан кейін кері транскрипция екі геном көшірмесі арасында шаблон алмасумен (көшірме таңдау рекомбинациясы) бірге жүреді. Шаблон алмасу (рекомбинация) геномның тұтастығын сақтау және зақымдалған геномдарды қалпына келтіру механизмі ретінде қажет болып көрінеді. Фаг полимеразасында 3'-тен 5'-ке қарай әрекет ететін экзонуклеазалық белсенділігі де бар, бұл белсенділік жаңадан енгізілген негіздерді түзетуге және өңдеуге қолданылады. Температураға сезімтал ДНК полимеразасы бар фагтың мутанты, рұқсат етілген температурада өскенде, жабайы типті фагқа қарағанда екі есе жоғары жиілікте рекомбинацияға ұшырайтыны байқалды. Фагтың ДНК полимеразасындағы мутациялық өзгеріс репликация кезінде шаблон алмасуды (көшірме таңдау рекомбинациясы) ынталандыра алады деп жорамалданды.