Репликация ДНК и ДНК-полимеразы

Введение

Форма репликации ДНК

ДНК-полимераза является членом семейства ферментов, катализирующих синтез молекул ДНК из нуклеозидтрифосфатов – молекулярных предшественников ДНК. Эти ферменты необходимы для репликации ДНК и обычно работают группами, создавая два идентичных дуплекса ДНК из одного исходного дуплекса ДНК. В ходе этого процесса ДНК-полимераза "считывает" существующие цепи ДНК, создавая две новые цепи, комплементарные существующим. Эти ферменты катализируют химическую реакцию:

дезоксинуклеозидтрифосфат + ДНКn → пирофосфат + ДНКn+1. ДНК-полимераза добавляет нуклеотиды к 3'-концу цепи ДНК, по одному нуклеотиду за раз. Каждый раз, когда клетка делится, ДНК-полимеразы необходимы для дублирования ДНК клетки, чтобы копия исходной молекулы ДНК могла быть передана каждой дочерней клетке. Таким образом, генетическая информация передается из поколения в поколение. Прежде чем репликация может начаться, фермент, называемый геликазой, раскручивает молекулу ДНК из ее плотно свернутой формы, разрывая водородные связи между нуклеотидными основаниями. Это раскрывает или "расплетает" двойную спираль ДНК, образуя две одноцепочечные ДНК, которые могут быть использованы в качестве матриц для репликации в описанной выше реакции.

История

В 1956 году Артур Корнберг и его коллеги обнаружили ДНК-полимеразу I (Pol I) у Escherichia coli. Они описали процесс репликации ДНК, посредством которого ДНК-полимераза копирует последовательность оснований комплементарной цепи ДНК. Корнберг позже был удостоен Нобелевской премии по физиологии или медицине в 1959 году за эту работу. ДНК-полимераза II была обнаружена Томасом Корнбергом (сыном Артура Корнберга) и Малкольмом Э. Гефтером в 1970 году в ходе дальнейшего изучения роли Pol I в репликации ДНК у E. coli. В E. coli было обнаружено еще три ДНК-полимеразы, включая ДНК-полимеразу III (открытую в 1970-х годах) и ДНК-полимеразы IV и V (открытые в 1999 году).

Функция

Основная функция ДНК-полимеразы – синтезировать ДНК из дезоксирибонуклеотидов, строительных блоков ДНК. Копии ДНК создаются путем спаривания нуклеотидов с основаниями, присутствующими на каждой цепи исходной молекулы ДНК. Это спаривание всегда происходит в специфических комбинациях: цитозин с гуанином и тимин с аденином, образуя две отдельные пары соответственно. В отличие от этого, РНК-полимеразы синтезируют РНК из рибонуклеотидов из РНК или ДНК. При синтезе новой ДНК ДНК-полимераза может добавлять свободные нуклеотиды только к 3'-концу вновь формирующейся цепи. Это приводит к удлинению новой цепи в направлении 5'–3'. Важно отметить, что направленность новой цепи (дочерней цепи) противоположна направлению, в котором ДНК-полимераза движется вдоль цепи-матрицы. Поскольку ДНК-полимераза требует свободной 3'-OH группы для инициации синтеза, она может синтезировать только в одном направлении, удлиняя 3'-конец уже существующей нуклеотидной цепи. Следовательно, ДНК-полимераза движется вдоль цепи-матрицы в направлении 3'–5', а дочерняя цепь формируется в направлении 5'–3'. Эта разница позволяет образовавшейся двухцепочечной ДНК состоять из двух цепей ДНК, антипараллельных друг другу. Функция ДНК-полимеразы не является безупречной: фермент делает примерно одну ошибку на миллиард копируемых пар оснований. Коррекция ошибок – свойство некоторых, но не всех ДНК-полимераз. Этот процесс исправляет ошибки в новосинтезированной ДНК. Когда распознается неправильная пара оснований, ДНК-полимераза отступает на одну пару оснований ДНК назад. 3'–5' экзонуклеазная активность фермента позволяет вырезать неправильную пару оснований (эта активность известна как вычитка). После вырезания основания полимераза может повторно вставить правильное основание, и репликация может продолжаться в прямом направлении. Это сохраняет целостность исходной цепи ДНК, которая передается дочерним клеткам. Точность крайне важна в репликации ДНК. Несоответствия в спаривании оснований ДНК потенциально могут привести к дисфункциональным белкам и даже к раку. Многие ДНК-полимеразы содержат экзонуклеазный домен, который участвует в обнаружении несоответствий пар оснований и последующем удалении неправильного нуклеотида для его замены правильным. Форма и взаимодействия, обеспечивающие соответствие пары оснований Уотсона-Крика, в первую очередь способствуют обнаружению ошибок. Водородные связи играют ключевую роль в связывании и взаимодействии пар оснований. Потеря взаимодействия, возникающая при несоответствии, считается причиной сдвига баланса в связывании праймера-матрицы от полимеразы к экзонуклеазному домену. Кроме того, включение неправильного нуклеотида вызывает замедление полимеризации ДНК. Эта задержка дает время для переключения ДНК с полимеразного сайта на экзонуклеазный сайт. Различные конформационные изменения и потеря взаимодействия происходят при различных несоответствиях. При несоответствии пурина и пиримидина происходит смещение пиримидина к большой бороздке и пурина к малой бороздке. Относительно формы связующего кармана ДНК-полимеразы возникают стерические конфликты между пурином и остатками в малой бороздке, а пиримидин теряет важные ван-дер-ваальсовы и электростатические взаимодействия. Несоответствия пиримидин:пиримидин и пурин:пурин проявляют менее заметные изменения, поскольку основания смещаются к большой бороздке, и стерические препятствия уменьшаются. Однако, несмотря на то, что различные несоответствия приводят к различным стерическим свойствам, ДНК-полимераза все же способна обнаруживать и дифференцировать их равномерно, поддерживая точность репликации ДНК. Полимеризация ДНК также критически важна для многих процессов мутагенеза и широко используется в биотехнологиях.

The main function of DNA polymerase is to synthesize DNA from deoxyribonucleotides, the building blocks of DNA. The DNA copies are created by the pairing of nucleotides to bases present on each strand of the original DNA molecule. This pairing always occurs in specific combinations, with cytosine along with guanine, and thymine along with adenine, forming two separate pairs, respectively. By contrast, RNA polymerases synthesize RNA from ribonucleotides from either RNA or DNA. When synthesizing new DNA, DNA polymerase can add free nucleotides only to the 3' end of the newly forming strand. This results in elongation of the newly forming strand in a 5'–3' direction. It is important to note that the directionality of the newly forming strand (the daughter strand) is opposite to the direction in which DNA polymerase moves along the template strand. Since DNA polymerase requires a free 3' OH group for initiation of synthesis, it can synthesize in only one direction by extending the 3' end of the preexisting nucleotide chain. Hence, DNA polymerase moves along the template strand in a 3'–5' direction, and the daughter strand is formed in a 5'–3' direction. This difference enables the resultant double strand DNA formed to be composed of two DNA strands that are antiparallel to each other. The function of DNA polymerase is not quite perfect, with the enzyme making about one mistake for every billion base pairs copied. Error correction is a property of some, but not all DNA polymerases. This process corrects mistakes in newly synthesized DNA. When an incorrect base pair is recognized, DNA polymerase moves backwards by one base pair of DNA. The 3'–5' exonuclease activity of the enzyme allows the incorrect base pair to be excised (this activity is known as proofreading). Following base excision, the polymerase can re insert the correct base and replication can continue forwards. This preserves the integrity of the original DNA strand that is passed onto the daughter cells. Fidelity is very important in DNA replication. Mismatches in DNA base pairing can potentially result in dysfunctional proteins and could lead to cancer. Many DNA polymerases contain an exonuclease domain, which acts in detecting base pair mismatches and further performs in the removal of the incorrect nucleotide to be replaced by the correct one. The shape and the interactions accommodating the Watson and Crick base pair are what primarily contribute to the detection or error. Hydrogen bonds play a key role in base pair binding and interaction. The loss of an interaction, which occurs at a mismatch, is said to trigger a shift in the balance, for the binding of the template primer, from the polymerase, to the exonuclease domain. In addition, an incorporation of a wrong nucleotide causes a retard in DNA polymerization. This delay gives time for the DNA to be switched from the polymerase site to the exonuclease site. Different conformational changes and loss of interaction occur at different mismatches. In a purine:pyrimidine mismatch there is a displacement of the pyrimidine towards the major groove and the purine towards the minor groove. Relative to the shape of DNA polymerase's binding pocket, steric clashes occur between the purine and residues in the minor groove, and important van der Waals and electrostatic interactions are lost by the pyrimidine. Pyrimidine:pyrimidine and purine:purine mismatches present less notable changes since the bases are displaced towards the major groove, and less steric hindrance is experienced. However, although the different mismatches result in different steric properties, DNA polymerase is still able to detect and differentiate them so uniformly and maintain fidelity in DNA replication. DNA polymerization is also critical for many mutagenesis processes and is widely employed in biotechnologies.

Структура

Известные ДНК-полимеразы обладают высококонсервативной структурой, что означает, что их основные каталитические субъединицы очень мало различаются у разных видов, независимо от их доменной организации. Консервативные структуры обычно свидетельствуют о важных, незаменимых функциях клетки, поддержание которых дает эволюционные преимущества. Форму можно описать как напоминающую правую руку с областями, соответствующими большому пальцу, указательному пальцу и ладони. Ладонная область, по-видимому, функционирует в качестве катализатора переноса фосфорильных групп в реакции фосфорилирования. ДНК связывается с ладонью, когда фермент активен. Считается, что эта реакция катализируется механизмом с участием двух ионов металла. Область, соответствующая указательному пальцу, выполняет функцию связывания нуклеозидтрифосфатов с основанием матрицы. Область, соответствующая большому пальцу, предположительно играет роль в процессивности, транслокации и позиционировании ДНК.

Процессивность

Быстрый катализ ДНК-полимеразы обусловлен её процессивностью. Процессивность – это характеристика ферментов, функционирующих на полимерных субстратах. В случае ДНК-полимеразы, степень процессивности относится к среднему числу нуклеотидов, добавляемых при каждом связывании фермента с матрицей. В среднем, ДНК-полимеразе требуется около одной секунды для поиска и связывания с местом соединения праймера и матрицы. После связывания, непроцессивная ДНК-полимераза добавляет нуклеотиды со скоростью один нуклеотид в секунду. Однако процессивные ДНК-полимеразы добавляют несколько нуклеотидов в секунду, значительно увеличивая скорость синтеза ДНК. Степень процессивности напрямую пропорциональна скорости синтеза ДНК. Скорость синтеза ДНК в живой клетке впервые была определена как скорость удлинения ДНК фага T4 в E. coli, инфицированной фагом. В период экспоненциального роста ДНК при 37 °C эта скорость составляла 749 нуклеотидов в секунду. Способность ДНК-полимеразы скользить вдоль матрицы ДНК повышает её процессивность. На вилке репликации наблюдается резкое увеличение процессивности. Это увеличение обеспечивается взаимодействием ДНК-полимеразы с белками, известными как скользящий зажим ДНК. Зажимы состоят из множества белковых субъединиц, объединенных в кольцеобразную структуру. Используя гидролиз АТФ, класс белков, называемых белками загрузки скользящего зажима, раскрывает кольцевую структуру скользящего зажима ДНК, обеспечивая его связывание и освобождение от цепи ДНК. Взаимодействие белок-белок с зажимом предотвращает диффузию ДНК-полимеразы от матрицы ДНК, тем самым гарантируя, что фермент связывается с тем же местом соединения праймера и матрицы и продолжает репликацию.

Прокариотическая полимераза

Прокариотические полимеразы существуют в двух формах: основной полимеразный комплекс и голоэнзим. Основной полимеразный комплекс синтезирует ДНК на основе ДНК-матрицы, но не способен самостоятельно или точно инициировать синтез. Голоэнзим обеспечивает точную инициацию синтеза.

Полиция

В семейство прокариотических полимераз А входит фермент ДНК-полимераза I (Pol I), кодируемый геном *polA* и широко распространенный среди прокариотов. Эта репаративная полимераза участвует в эксцизионной репарации, обладая 3'–5' и 5'–3' экзонуклеазной активностью, а также в обработке фрагментов Оказаки, образующихся при синтезе отстающей цепи. Pol I является наиболее распространенной полимеразой, составляя более 95% полимеразной активности в *E. coli*; однако были обнаружены клетки, лишенные Pol I, что указывает на возможность замещения активности Pol I четырьмя другими полимеразами. Pol I добавляет около 15-20 нуклеотидов в секунду, что свидетельствует о низкой процессивности. Вместо этого Pol I начинает добавлять нуклеотиды в месте соединения РНК-праймера и матрицы, известном как начало репликации (*ori*). Примерно в 400 пар оснований ниже по потоку от начала репликации, собирается голофермент Pol III и берет на себя репликацию с высокой процессивностью и эффективностью. Taq-полимераза – термостабильный фермент этого семейства, не обладающий способностью к корректуре.

Пол II

ДНК-полимераза II — это полимераза семейства B, кодируемая геном *polB*. Pol II обладает 3'–5' экзонуклеазной активностью и участвует в репарации ДНК, возобновлении репликации для преодоления повреждений, а её количество в клетке может увеличиваться от ~30–50 копий на клетку до ~200–300 при индукции SOS. Считается, что Pol II также служит резервной копией Pol III, поскольку она способна взаимодействовать с белками голоэнзима и проявлять высокую процессивность. Основная роль Pol II, предположительно, заключается в направлении полимеразной активности на вилке репликации и помощи заторможенной Pol III в преодолении терминальных неспариваний. Pfu ДНК-полимераза — это термостабильный фермент этого семейства, обнаруженный у гипертермофильной археи *Pyrococcus furiosus*. Детальная классификация разделяет семейство B у архей на B1, B2 и B3, при этом B2 представляет собой группу псевдоферментов. Pfu относится к семейству B3. Другие PolB, обнаруженные у архей, являются компонентами "Casposons" – Cas1-зависимых транспозонов.

Пол III

Холофермент ДНК-полимеразы III является основным ферментом, участвующим в репликации ДНК в *E. coli* и принадлежит к семейству полимераз C. Он состоит из трех комплексов: ядра pol III, фактора процессивности β-сдвижного зажима и комплекса загрузки зажима. Ядро состоит из трех субъединиц: α, центра полимеразной активности, ɛ, экзонуклеотидного корректора, и θ, который может выступать в роли стабилизатора для ɛ. Фактор процессивности β-сдвижного зажима также присутствует в двух экземплярах, по одному для каждого ядра, формируя зажим, охватывающий ДНК и обеспечивающий высокую процессивность. Третий комплекс представляет собой семисубъединичный (τ2γδδχψ) комплекс загрузки зажима. Старая учебниковая "модель тромбона" изображает элонгационный комплекс с двумя эквивалентами основного фермента на каждой репликативной вилке (RF), по одному для каждой цепи – ведущей и отстающей. Исследования с использованием флуоресцентной микроскопии показали, что синтез ведущей цепи может быть не полностью непрерывным, и Pol III* (т.е. субъединицы голофермента α, ε, τ, δ и χ без β2-сдвижного зажима) демонстрирует высокую частоту диссоциации от активных RF. В этих исследованиях скорость смены репликативной вилки составляла около 10 с для Pol III*, 47 с для β2-сдвижного зажима и 15 мин для DnaB-геликазы. Это позволяет предположить, что DnaB-геликаза может оставаться стабильно связанной с RF и служить точкой нуклеации для компетентного голофермента. Исследования отдельных молекул *in vitro* показали, что Pol III* имеет высокую скорость смены RF при избытке, но остается стабильно связанным с репликативными вилками при лимитирующей концентрации. Pol IV – это полимераза семейства Y, экспрессируемая геном *dinB*, который активируется посредством SOS-индукции, вызванной остановкой полимераз на репликативной вилке. Во время SOS-индукции продукция Pol IV увеличивается в десять раз, и одна из ее функций – ингибирование процессивности голофермента Pol III. Это создает контрольную точку, останавливает репликацию и дает время для восстановления повреждений ДНК посредством соответствующего пути репарации. Другая функция Pol IV заключается в осуществлении транслезионного синтеза на остановленной репликативной вилке, например, обходя N2-дезоксигуаниновые аддукты быстрее, чем проходя через неповрежденную ДНК. Клетки, лишенные гена *dinB*, демонстрируют повышенную частоту мутагенеза, вызванного повреждающими ДНК агентами.

DNA polymerase III holoenzyme is the primary enzyme involved in DNA replication in E. coli and belongs to family C polymerases. It consists of three assemblies: the pol III core, the beta sliding clamp processivity factor, and the clamp loading complex. The core consists of three subunits: α, the polymerase activity hub, ɛ, exonucleolytic proofreader, and θ, which may act as a stabilizer for ɛ. The beta sliding clamp processivity factor is also present in duplicate, one for each core, to create a clamp that encloses DNA allowing for high processivity. The third assembly is a seven subunit (τ2γδδχψ) clamp loader complex. The old textbook "trombone model" depicts an elongation complex with two equivalents of the core enzyme at each replication fork (RF), one for each strand, the lagging and leading. In cell fluorescent microscopy has revealed that leading strand synthesis may not be completely continuous, and Pol III* (i. e., the holoenzyme α, ε, τ, δ and χ subunits without the ß2 sliding clamp) has a high frequency of dissociation from active RFs. In these studies, the replication fork turnover rate was about 10s for Pol III*, 47s for the ß2 sliding clamp, and 15m for the DnaB helicase. This suggests that the DnaB helicase may remain stably associated at RFs and serve as a nucleation point for the competent holoenzyme. In vitro single molecule studies have shown that Pol III* has a high rate of RF turnover when in excess, but remains stably associated with replication forks when concentration is limiting. Pol IV is a Family Y polymerase expressed by the dinB gene that is switched on via SOS induction caused by stalled polymerases at the replication fork. During SOS induction, Pol IV production is increased tenfold and one of the functions during this time is to interfere with Pol III holoenzyme processivity. This creates a checkpoint, stops replication, and allows time to repair DNA lesions via the appropriate repair pathway. Another function of Pol IV is to perform translesion synthesis at the stalled replication fork like, for example, bypassing N2 deoxyguanine adducts at a faster rate than transversing undamaged DNA. Cells lacking the dinB gene have a higher rate of mutagenesis caused by DNA damaging agents.

Пол V

ДНК-полимераза V (Pol V) — это ДНК-полимераза семейства Y, участвующая в SOS-ответе и механизмах репарации ДНК посредством транслезионного синтеза. Транскрипция Pol V через гены *umuDC* строго регулируется для производства Pol V только при наличии поврежденной ДНК в клетке, что запускает SOS-ответ. Застревание полимеразы вызывает связывание RecA с одноцепочечной ДНК (ssDNA), что приводит к аутолизу белка LexA. LexA затем теряет способность подавлять транскрипцию оперона *umuDC*. Тот же нуклеопротеин RecA-ssDNA посттрансляционно модифицирует белок UmuD в белок UmuD'. UmuD и UmuD' образуют гетеродимер, который взаимодействует с UmuC, который, в свою очередь, активирует полимеразную каталитическую активность UmuC' на поврежденной ДНК. В *E. coli* была предложена модель "набора инструментов" полимеразы для переключения с pol III на pol IV на заторможенной репликационной вилке, где обе полимеразы одновременно связываются с β-зажимом. Однако участие более чем одной TLS-полимеразы, работающей последовательно для обхода повреждения, пока не было показано в *E. coli*. Более того, Pol IV может катализировать как вставку, так и удлинение с высокой эффективностью, в то время как pol V считается основной SOS TLS-полимеразой. Примером является обход внутрицепочечного сшивания гуанина и тимина, где, основываясь на различиях в мутационных сигнатурах двух полимераз, было показано, что pol IV и pol V конкурируют за TLS при обходе внутрицепочечного сшивания. В 1998 году семейство D ДНК-полимераз было обнаружено в *Pyrococcus furiosus* и *Methanococcus jannaschii*. Комплекс PolD представляет собой гетеродимер из двух цепей, каждая из которых кодируется DP1 (малая субъединица с функцией корректуры) и DP2 (большая каталитическая субъединица). В отличие от других ДНК-полимераз, структура и механизм каталитического ядра DP2 напоминают структуру многосубъединичных РНК-полимераз. Интерфейс DP1-DP2 напоминает цинковые пальцы полимеразы класса B у эукариот и ее малую субъединицу, и, вероятно, является предшественником малой субъединицы Pol α и ε, обеспечивая возможности корректуры, которые сейчас утрачены у эукариот. Его N-концевой домен HSH по структуре похож на белки AAA, особенно на субъединицы Pol III δ и RuvB. DP2 содержит домен KH класса II. Предполагается, что ДНК-полимераза семейства D первой эволюционировала в клеточных организмах, и что репликативная полимераза последнего универсального общего предка (LUCA) принадлежала к семейству D.

DNA polymerase V (Pol V) is a Y family DNA polymerase that is involved in SOS response and translesion synthesis DNA repair mechanisms. Transcription of Pol V via the umuDC genes is highly regulated to produce only Pol V when damaged DNA is present in the cell generating an SOS response. Stalled polymerases causes RecA to bind to the ssDNA, which causes the LexA protein to autodigest. LexA then loses its ability to repress the transcription of the umuDC operon. The same RecA ssDNA nucleoprotein posttranslationally modifies the UmuD protein into UmuD' protein. UmuD and UmuD' form a heterodimer that interacts with UmuC, which in turn activates umuC's polymerase catalytic activity on damaged DNA. In E. coli, a polymerase "tool belt" model for switching pol III with pol IV at a stalled replication fork, where both polymerases bind simultaneously to the β clamp, has been proposed. However, the involvement of more than one TLS polymerase working in succession to bypass a lesion has not yet been shown in E. coli. Moreover, Pol IV can catalyze both insertion and extension with high efficiency, whereas pol V is considered the major SOS TLS polymerase. One example is the bypass of intra strand guanine thymine cross link where it was shown on the basis of the difference in the mutational signatures of the two polymerases, that pol IV and pol V compete for TLS of the intra strand crosslink.]] In 1998, the family D of DNA polymerase was discovered in Pyrococcus furiosus and Methanococcus jannaschii. The PolD complex is a heterodimer of two chains, each encoded by DP1 (small proofreading) and DP2 (large catalytic). Unlike other DNA polymerases, the structure and mechanism of the DP2 catalytic core resemble that of multi subunit RNA polymerases. The DP1 DP2 interface resembles that of Eukaryotic Class B polymerase zinc finger and its small subunit. is likely the precursor of small subunit of Pol α and ε, providing proofreading capabilities now lost in Eukaryotes. Its N terminal HSH domain is similar to AAA proteins, especially Pol III subunit δ and RuvB, in structure. DP2 has a Class II KH domain. It has been proposed that family D DNA polymerase was the first to evolve in cellular organisms and that the replicative polymerase of the Last Universal Cellular Ancestor (LUCA) belonged to family D.

Полимеразы β, λ, σ, μ (бета, лямбда, сигма, му) и TdT

Полимеразы семейства X содержат хорошо известную эукариотическую полимеразу pol β (бета), а также другие эукариотические полимеразы, такие как Pol σ (сигма), Pol λ (лямбда), Pol μ (мю) и терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT). Полимеразы семейства X в основном встречаются у позвоночных, некоторые – у растений и грибов. Эти полимеразы обладают высококонсервативными областями, включающими два мотива "спираль-петля-спираль", критически важных для взаимодействий ДНК-полимеразы. Один мотив расположен в 8 кДа домене, взаимодействующем с нижележащей цепью ДНК, а другой – в домене "большого пальца", взаимодействующем с праймерной цепью. Pol β, кодируемая геном POLB, необходима для коротко-заплатного удаления оснований, пути репарации ДНК, который имеет важное значение для восстановления алкилированных или окисленных оснований, а также апуринических/апиримидиновых участков. Pol λ и Pol μ, кодируемые генами POLL и POLM соответственно, участвуют в негомологичном соединении концов, механизме воссоединения разрывов двойных нитей ДНК, вызванном перекисью водорода и ионизирующим излучением, соответственно. TdT экспрессируется только в лимфоидной ткани и добавляет "n нуклеотидов" к двунитевым разрывам, формирующимся во время V(D)J-рекомбинации, способствуя иммунологическому разнообразию.

Полимеразы α, δ и ε (альфа, дельта и эпсилон)

Pol α (альфа), Pol δ (дельта) и Pol ε (эпсилон) относятся к семейству B полимераз и являются основными полимеразами, участвующими в репликации ядерной ДНК. Комплекс Pol α (комплекс ДНК-примазы Pol α) состоит из четырех субъединиц: каталитической субъединицы POLA1, регуляторной субъединицы POLA2, а также малых и больших субъединиц примазы PRIM1 и PRIM2 соответственно. После того как примаза синтезировала РНК-праймер, Pol α начинает репликацию, удлиняя праймер примерно на 20 нуклеотидов. Благодаря своей высокой процессивности, Pol δ перехватывает синтез ведущей и отстающей цепей у Pol α. Pol ε кодируется генами POLE1 (каталитическая субъединица), POLE2 и POLE3. Сообщалось, что функция Pol ε заключается в удлинении ведущей цепи во время репликации, в то время как Pol δ преимущественно реплицирует отстающую цепь; однако, недавние данные указывают на то, что Pol δ может играть роль и в репликации ведущей цепи ДНК. C-концевой регион Pol ε, называемый "реликтом полимеразы", несмотря на необязательность для полимеразной активности, содержит более крупный "ладонный" домен, обеспечивающий высокую процессивность независимо от PCNA. По сравнению с другими полимеразами семейства B, семейство DEDD-экзонуклеаз, ответственное за вычитку, инактивировано в Pol α.

Полимеразы η, ι и κ (эта, йота и каппа)

Pol η (эта), Pol ι (йота) и Pol κ (каппа) – это ДНК-полимеразы семейства Y, участвующие в репарации ДНК посредством синтеза транслезии и кодируемые генами POLH, POLI и POLK соответственно. Члены семейства Y имеют пять общих мотивов, способствующих связыванию субстрата и 3'-конца праймера, и все они включают типичные домены – большой палец, ладонь и указательный палец, а также дополнительные домены, такие как «малый палец» (LF), домен, связанный с полимеразой (PAD), или «запястье». Однако активный центр различается между членами семейства из-за различных типов повреждений, которые они восстанавливают. ДНК-полимеразы семейства Y обладают низкой точностью, но доказано, что они приносят больше пользы, чем вреда, поскольку мутации, затрагивающие полимеразу, могут вызывать различные заболевания, такие как рак кожи и вариант пигментной ксеродермии (XPS). Важность этих полимераз подтверждается тем фактом, что ген, кодирующий ДНК-полимеразу η, обозначается как XPV, поскольку потеря этого гена приводит к развитию варианта пигментной ксеродермии. Pol η особенно важна для обеспечения точного синтеза транслезии повреждений ДНК, вызванных ультрафиолетовым излучением. Функциональность Pol κ изучена не полностью, но исследователи выявили две вероятные функции. Считается, что Pol κ может выступать в роли удлинителя или вставщика определенного основания в определенных участках поврежденной ДНК. Все три полимеразы синтеза транслезии, вместе с Rev1, рекрутируются к поврежденным участкам посредством репликационных ДНК-полимераз, процесс которых заблокирован. Существуют два пути репарации повреждений, что позволяет исследователям предположить, что выбор пути зависит от того, в какой цепи ДНК находится повреждение – в ведущей или отстающей.

Полимеразы Rev1 и ζ (зета)

Полизета ζ, еще одна полимераза семейства B, состоит из двух субъединиц: Rev3 – каталитической субъединицы, и Rev7 (MAD2L2), которая усиливает каталитическую функцию полимеразы и участвует в транслезионном синтезе. Полизета ζ лишена 3'-5'-экзонуклеазной активности и уникальна тем, что способна удлинять праймеры с терминальными несовпадениями. Rev1 содержит три области, представляющие интерес: BRCT-домен, домен связывания убиквитина и C-концевой домен, и обладает dCMP-трансферазой, которая добавляет дезоксицитидин напротив повреждений, останавливающих репликативные полимеразы Pol δ и Pol ε. Эти остановившиеся полимеразы активируют убиквитинные комплексы, которые, в свою очередь, диссоциируют репликационные полимеразы и рекрутируют Pol ζ и Rev1. Вместе Pol ζ и Rev1 добавляют дезоксицитидин, а Pol ζ продолжает синтез, обходя повреждение. Впоследствии, посредством пока не выясненного механизма, Pol ζ диссоциирует, а репликационные полимеразы вновь ассоциируются и продолжают репликацию. Pol ζ и Rev1 не необходимы для репликации, однако потеря гена REV3 у дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae может привести к повышенной чувствительности к повреждающим ДНК агентам из-за коллапса репликационных вилок, где репликативные полимеразы остановились.

Теломераза

Теломераза – это рибонуклеопротеин, который функционирует для репликации концов линейных хромосом, поскольку нормальная ДНК-полимераза не способна реплицировать концы, или теломеры. Одноцепочечный 3'-выступ двуцепочечной хромосомы с последовательностью 5' TTAGGG 3' рекрутирует теломеразу. Теломераза действует подобно другим ДНК-полимеразам, удлиняя 3'-конец, но, в отличие от них, теломераза не требует матрицы. Субъединица TERT, являющаяся примером обратной транскриптазы, использует РНК-субъединицу для формирования праймерно-матричного комплекса, позволяющего теломеразе удлинять 3'-конец хромосомных концов. Считается, что постепенное уменьшение размера теломер в результате многочисленных репликаций на протяжении жизни связано с проявлениями старения. Любая мутация, приводящая к ограниченной или нефункционирующей Pol γ, оказывает значительное влияние на мтДНК и является наиболее частой причиной аутосомно-наследуемых митохондриальных заболеваний. Pol γ содержит C-концевой домен полимеразы и N-концевой домен 3'-5'-экзонуклеазы, соединенные линкерной областью, которая связывает вспомогательную субъединицу. Вспомогательная субъединица связывает ДНК и необходима для процессивности Pol γ. Точечная мутация A467T в линкерной области ответственна за более чем треть всех митохондриальных заболеваний, связанных с Pol γ. Хотя многие гомологи Pol θ, кодируемые геном POLQ, встречаются у эукариот, ее функция до конца не выяснена. Последовательность аминокислот в C-конце определяет Pol θ как полимеразу семейства A, хотя частота ошибок для Pol θ больше соответствует полимеразам семейства Y. Pol θ удлиняет неправильно спаренные праймерные концы и может обходить абазические участки, добавляя нуклеотид. Она также обладает дезоксирибофосфодиэстеразной (dRPase) активностью в полимеразном домене и может проявлять АТФазную активность в непосредственной близости от одноцепочечной ДНК. Pol ν (nu) считается наименее эффективным из ферментов полимеразы. Однако ДНК-полимераза nu играет активную роль в репарации гомологией во время клеточных реакций на перекрестные связи, выполняя свою функцию в комплексе с геликазой.

Telomerase is a ribonucleoprotein which functions to replicate ends of linear chromosomes since normal DNA polymerase cannot replicate the ends, or telomeres. The single strand 3' overhang of the double strand chromosome with the sequence 5' TTAGGG 3' recruits telomerase. Telomerase acts like other DNA polymerases by extending the 3' end, but, unlike other DNA polymerases, telomerase does not require a template. The TERT subunit, an example of a reverse transcriptase, uses the RNA subunit to form the primer–template junction that allows telomerase to extend the 3' end of chromosome ends. The gradual decrease in size of telomeres as the result of many replications over a lifetime are thought to be associated with the effects of aging. Any mutation that leads to limited or non functioning Pol γ has a significant effect on mtDNA and is the most common cause of autosomal inherited mitochondrial disorders. Pol γ contains a C terminus polymerase domain and an N terminus 3'–5' exonuclease domain that are connected via the linker region, which binds the accessory subunit. The accessory subunit binds DNA and is required for processivity of Pol γ. Point mutation A467T in the linker region is responsible for more than one third of all Pol γ associated mitochondrial disorders. While many homologs of Pol θ, encoded by the POLQ gene, are found in eukaryotes, its function is not clearly understood. The sequence of amino acids in the C terminus is what classifies Pol θ as Family A polymerase, although the error rate for Pol θ is more closely related to Family Y polymerases. Pol θ extends mismatched primer termini and can bypass abasic sites by adding a nucleotide. It also has Deoxyribophosphodiesterase (dRPase) activity in the polymerase domain and can show ATPase activity in close proximity to ssDNA. Pol ν (nu) is considered to be the least effective of the polymerase enzymes. However, DNA polymerase nu plays an active role in homology repair during cellular responses to crosslinks, fulfilling its role in a complex with helicase.

Обратная транскриптаза

Ретровирусы кодируют необычную ДНК-полимеразу, называемую обратной транскриптазой, которая является РНК-зависимой ДНК-полимеразой (RdDp) и синтезирует ДНК на основе РНК-матрицы. Семейство обратных транскриптаз обладает как ДНК-полимеразной, так и RNase H-активностью, которая разрушает РНК, комплементарную ДНК. Примером ретровируса является ВИЧ. После инфицирования обратная транскрипция сопровождается переключением матриц между двумя копиями генома (рекомбинация с выбором копии). Переключение матриц (рекомбинация) представляется необходимым для поддержания целостности генома и в качестве механизма восстановления поврежденных геномов. Фаговая полимераза также обладает экзонуклеазной активностью, действующей в направлении 3' → 5', которая используется для вычитки и редактирования вновь вставленных оснований. Было обнаружено, что фаговый мутант с ДНК-полимеразой, чувствительной к температуре, при культивировании на благоприятных температурах подвергается рекомбинации с частотой примерно в два раза выше, чем у фага дикого типа. Предполагается, что мутационное изменение в фаговой ДНК-полимеразе может стимулировать переключение нитей матрицы (рекомбинацию с выбором копии) во время репликации.