Рибозималар: РНҚ-ның катализдік қасиеттері мен эволюциялық маңызы

Кіріспе

РНК молекулаларының түрлері химиялық.

Рибозимдер (рибонуклеин қышқылы ферменттері) – белгілі бір биохимиялық реакцияларды катализдеуге қабілетті РНК молекулалары, оның ішінде гендік экспрессияда РНК тігілуін, ақуыз ферменттерінің әрекетіне ұқсас. 1982 жылы рибозимдердің табылуы РНК-ның генетикалық материал (ДНҚ сияқты) және биологиялық катализатор (ақуыз ферменттері сияқты) бола алатынын көрсетті және РНК әлемі гипотезасына үлес қосты, бұл РНК-ның пребиотикалық өздігінен көбейетін жүйелердің эволюциясында маңызды рөл атқаруы мүмкін екенін көрсетеді. Мысалы, ең кішкентай белгілі рибозим (GUGGC 3') PheAMP қатысуымен GCCU 3' тізбегін аминоацилдай алады. Рибосома ішінде рибозимдер ақуыз синтезі кезінде аминқышқылдарын байланыстыратын ірі рибосомалық РНК құрамының бір бөлігі ретінде жұмыс істейді. Олар РНК-ның тігілуі, вирус репликациясы және трансферлік РНК биосинтезі сияқты РНК өңдеу реакцияларының әртүрлі түрлеріне де қатысады. Рибозимдердің мысалдары: балға тәрізді рибозим, VS рибозим, ледзим және түймеше рибозим. Өмірдің пайда болуын РНК әлемі гипотезасы арқылы зерттейтін ғалымдар өзін-өзі көбейтуге қабілетті рибозимді табуға ұмтылып келеді, ол РНК полимерлерін катализдік жолмен синтездеуге мүмкіндік беруі керек. Бұл пребиотикалық жағдайларда, ақпараттың жоғалуын болдырмау үшін көшірудің жоғары дәлдігімен жүзеге асуы тиіс, бірақ көшіру процесінде кездейсоқ қателерге де мүмкіндік беру керек, бұл Дарвин эволюциясының жүруіне жағдай жасайды. Рибозимдерді терапиялық заттар ретінде, белгілі РНК тізбектерін бөлуге бағытталған ферменттер ретінде, биосенсорлар ретінде және функционалды геномика мен гендерді анықтауда қолдану үшін жасауға талпыныстар жасалып жатыр.

Ашылу

Рибозимдер табылар алдында ферменттер – каталитикалық ақуыздар – жалғыз биологиялық катализаторлар болатын. 1967 жылы Карл Вузе, Фрэнсис Крик және Лесли Оргел РНК катализатор ретінде әрекет ете алатынын алғаш рет ұсынды. Бұл идея РНК күрделі екінші құрылымдарды құрай алатындығына негізделген. Осы рибозимдер РНК транскриптісінің интронында, сондай-ақ пре-тРНК-ның жетілуіне қатысы бар РНАза P кешенінің РНК компонентінде табылды. 1989 жылы Томас Р. Чех пен Сидни Альтман «РНК-ның каталитикалық қасиеттерін ашқаны үшін» химия саласындағы Нобель сыйлығын бөлісті. Рибозим терминін алғаш рет Келли Крюгер және авторлар тобы 1982 жылы Cell журналында жарияланған мақалада енгізді. Биологияда катализ ақуыздарға ғана тән деген сенім қалыптасқан. Дегенмен, РНК катализінің идеясы өмірдің пайда болуына қатысты көне сұрақтан туындайды: жасушаның жұмысын атқаратын ферменттер ме, әлде ферменттерді өндіруге қажетті ақпаратты таситын нуклеин қышқылдары ма, қайсысы бірінші болады? «Катализатор ретінде рибонуклеин қышқылдары» тұжырымы осы мәселені шешеді. РНК, мәнінде, тауық та, жұмыртқа да болуы мүмкін. 1980-ші жылдары Колорадо Боулдер университетінің профессоры Томас Чех Tetrahymena thermophila-да рибосомалық РНК геніндегі интрондардың кесілуін зерттеді. Ол дәнекерлеу реакциясына жауапты ферментті тазартуға тырысқанда, интрон жасушалық экстракт қосылмағанда да кесіле алатынын анықтады. Қанша тырысса да, Чех пен оның әріптестері дәнекерлеу реакциясымен байланысты ешқандай ақуызды анықтай алмады. Көп жұмыс істегеннен кейін Чех РНК-ның интрон бөлігі фосфодиэстерлік байланыстарды үзіп, қайта құрастыра алатынын болжады. Шамамен сол уақытта Йель университетінің профессоры Сидни Альтман тРНК молекулаларының жасушада қалай өңделетінін зерттеген кезде, ол және оның әріптестері РНАза P деп аталатын ферментті бөліп алды, ол прекурсорлық тРНК-ны белсенді тРНК-ға айналдыруға жауапты. Олардың үлкен таңқалуына орай, РНАза P құрамында ақуызбен қатар РНК да бар екенін және РНК белсенді ферменттің маңызды құрамы екенін анықтады. Бұл идея оларға соншалықты жат болды, олар өз нәтижелерін жариялауда қиындықтарға тап болды. Келесі жылы Альтман РНК катализатор ретінде әрекет ете алатынын көрсетті, РНАза P РНК суббірлігі кез келген ақуыз компоненті болмағанда прекурсорлық тРНК-ны белсенді тРНК-ға катализдей алатынын көрсетті. Чех пен Альтманның ашқаннан кейін басқа зерттеушілер де өзінен-өзі кесілетін РНК немесе катализдік РНК молекулаларының басқа да мысалдары табылды. Көптеген рибозимдер шаштық немесе балға тәрізді белсенді орталыққа және оларға басқа РНК молекулаларын белгілі бір тізбектерде кесуге мүмкіндік беретін ерекше екінші құрылымға ие. Қазір кез келген РНК молекуласын арнайы кесетін рибозимдер жасауға болады. Бұл РНК катализаторларының фармацевтикалық қолданылуы болуы мүмкін. Мысалы, АИТВ-ның РНК-сын кесуге арналған рибозим жасалды. Егер мұндай рибозимді жасуша жасаса, барлық кіретін вирус бөлшектерінің РНК-сы рибозиммен кесіліп, инфекцияның алдын алады.

Before the discovery of ribozymes, enzymes—which are defined as catalytic proteins—were the only known biological catalysts. In 1967, Carl Woese, Francis Crick, and Leslie Orgel were the first to suggest that RNA could act as a catalyst. This idea was based upon the discovery that RNA can form complex secondary structures. These ribozymes were found in the intron of an RNA transcript, which removed itself from the transcript, as well as in the RNA component of the RNase P complex, which is involved in the maturation of pre tRNAs. In 1989, Thomas R. Cech and Sidney Altman shared the Nobel Prize in chemistry for their "discovery of catalytic properties of RNA". The term ribozyme was first introduced by Kelly Kruger et al. in a paper published in Cell in 1982. It had been a firmly established belief in biology that catalysis was reserved for proteins. However, the idea of RNA catalysis is motivated in part by the old question regarding the origin of life: Which comes first, enzymes that do the work of the cell or nucleic acids that carry the information required to produce the enzymes? The concept of "ribonucleic acids as catalysts" circumvents this problem. RNA, in essence, can be both the chicken and the egg. In the 1980s, Thomas Cech, at the University of Colorado Boulder, was studying the excision of introns in a ribosomal RNA gene in Tetrahymena thermophila. While trying to purify the enzyme responsible for the splicing reaction, he found that the intron could be spliced out in the absence of any added cell extract. As much as they tried, Cech and his colleagues could not identify any protein associated with the splicing reaction. After much work, Cech proposed that the intron sequence portion of the RNA could break and reform phosphodiester bonds. At about the same time, Sidney Altman, a professor at Yale University, was studying the way tRNA molecules are processed in the cell when he and his colleagues isolated an enzyme called RNase P, which is responsible for conversion of a precursor tRNA into the active tRNA. Much to their surprise, they found that RNase P contained RNA in addition to protein and that RNA was an essential component of the active enzyme. This was such a foreign idea that they had difficulty publishing their findings. The following year, Altman demonstrated that RNA can act as a catalyst by showing that the RNase P RNA subunit could catalyze the cleavage of precursor tRNA into active tRNA in the absence of any protein component. Since Cech's and Altman's discovery, other investigators have discovered other examples of self cleaving RNA or catalytic RNA molecules. Many ribozymes have either a hairpin – or hammerhead – shaped active center and a unique secondary structure that allows them to cleave other RNA molecules at specific sequences. It is now possible to make ribozymes that will specifically cleave any RNA molecule. These RNA catalysts may have pharmaceutical applications. For example, a ribozyme has been designed to cleave the RNA of HIV. If such a ribozyme were made by a cell, all incoming virus particles would have their RNA genome cleaved by the ribozyme, which would prevent infection.

Құрылымы мен механизмі

Тек төрт мономерлік бірлік (нуклеотидтер) таңдауы болса да, ақуыздардағы 20 аминқышқылдық тізбектермен салыстырғанда, рибозимдер әртүрлі құрылымдар мен механизмдерге ие. Көп жағдайда олар өздерінің ақуыз әріптестерінің механизмдерін имитациялай алады. Мысалы, өздігінен кесілетін рибозим РНК-да 2’ гидроксил тобын нуклеофил ретінде пайдаланып SN2 реакциясын жүзеге асырады, бұл көпірлік фосфатқа шабуыл жасайды және N+1 негізінің 5’ оттегін шығарып тастау тобы ретінде әрекет етеді. Қарама-қарсылығы, RNase A, дәл осы реакцияны катализдейтін ақуыз, фосфат тірегіне шабуыл жасау үшін негіз ретінде гистидин мен лизиннің координациясын пайдаланады. Көбінесе бұл өзара әрекеттесулер фосфат тірегінің де, нуклеотид негізінің де қатысуымен жүзеге асады, нәтижесінде айқын конформациялық өзгерістер пайда болады. Металлдың қатысуымен фосфодиэстер тірегінің кесілуіне екі механизм класы тән. Бірінші механизмде ішкі 2’ OH тобы SN2 механизмі арқылы фосфор орталығына шабуыл жасайды. Металл иондары бұл реакцияны алдымен фосфат оттегімен координациялап, кейіннен оксианионды тұрақтандыру арқылы жеделдетеді. Екінші механизм де SN2 ығысуын қамтиды, бірақ нуклеофил РНК-ның өзінен емес, судан немесе экзогенді гидроксил тобынан келеді. Ең кішкентай рибозим – UUU, ол Mn2+ қатысуымен бірінші механизм арқылы GAAA тетрануклеотидінің G және A арасындағы кесілуін катализдей алады. Бұл тринуклеотидтің (комплементарлы тетрамердің орнына) осы реакцияны катализдеуіне себеп – UUU AAA жұптасуы 64 конформацияның арасындағы ең әлсіз және ең икемді тринуклеотид болып табылады, ол Mn2+ үшін байланыс орнын қамтамасыз етеді. Фосфорилдік трансфер металл иондарының қатысуынсыз да катализделген. Мысалы, панкреатикалық рибонуклеаза А және гепатит дельта вирусы (HDV) рибозимі металл иондарысыз қышқыл-негіздік катализ арқылы РНК тірегінің кесілуін катализдей алады. Шашқырыл рибозимі де металл иондарының қатысуынсыз РНК-ның өздігінен кесілуін катализдей алады, бірақ оның механизмі әлі де толыққанды түсініксіз. Модельдік жүйеде, катализатормен толықтыратын 3 негіз жұптары бар 4 нуклеотидтік субстраттың трансфенилаланинуын катализдейтін 5 нуклеотидтік РНК-да дивалентті катиондар қажет емес, мұнда катализатор/субстрат C3 рибозимін қысқарту арқылы жасалған. Рибозимдердің ең жақсы зерттелгендері, әдетте, өздерінің немесе басқа РНК-ның кесілуін катализдейтіндері болып табылады, мысалы, Чех және Альтманның бастапқы ашқандығындай. Дегенмен, рибозимдер реакциялардың кең ауқымын катализдейтіндей етіп жасалуы мүмкін, олардың көптеген түрлері тіршілікте болуы мүмкін, бірақ жасушаларда анықталмаған. РНК прионның патологиялық ақуыз конформациясын шаперонинге ұқсас механизм арқылы катализдей алады.

Despite having only four choices for each monomer unit (nucleotides), compared to 20 amino acid side chains found in proteins, ribozymes have diverse structures and mechanisms. In many cases they are able to mimic the mechanism used by their protein counterparts. For example, in self cleaving ribozyme RNAs, an in line SN2 reaction is carried out using the 2’ hydroxyl group as a nucleophile attacking the bridging phosphate and causing 5’ oxygen of the N+1 base to act as a leaving group. In comparison, RNase A, a protein that catalyzes the same reaction, uses a coordinating histidine and lysine to act as a base to attack the phosphate backbone. Often these interactions use both the phosphate backbone and the base of the nucleotide, causing drastic conformational changes. There are two mechanism classes for the cleavage of a phosphodiester backbone in the presence of metal. In the first mechanism, the internal 2’ OH group attacks the phosphorus center in a SN2 mechanism. Metal ions promote this reaction by first coordinating the phosphate oxygen and later stabling the oxyanion. The second mechanism also follows a SN2 displacement, but the nucleophile comes from water or exogenous hydroxyl groups rather than RNA itself. The smallest ribozyme is UUU, which can promote the cleavage between G and A of the GAAA tetranucleotide via the first mechanism in the presence of Mn2+. The reason why this trinucleotide (rather than the complementary tetramer) catalyzes this reaction may be because the UUU AAA pairing is the weakest and most flexible trinucleotide among the 64 conformations, which provides the binding site for Mn2+. Phosphoryl transfer can also be catalyzed without metal ions. For example, pancreatic ribonuclease A and hepatitis delta virus (HDV) ribozymes can catalyze the cleavage of RNA backbone through acid base catalysis without metal ions. Hairpin ribozyme can also catalyze the self cleavage of RNA without metal ions, but the mechanism for this is still unclear. In a model system, there is no requirement for divalent cations in a five nucleotide RNA catalyzing trans phenylalanation of a four nucleotide substrate with 3 base pairs complementary with the catalyst, where the catalyst/substrate were devised by truncation of the C3 ribozyme. The best studied ribozymes are probably those that cut themselves or other RNAs, as in the original discovery by Cech and Altman. However, ribozymes can be designed to catalyze a range of reactions, many of which may occur in life but have not been discovered in cells. RNA may catalyze folding of the pathological protein conformation of a prion in a manner similar to that of a chaperonin.

Рибозимдер мен өмірдің пайда болуы

РНҚ сондай-ақ тұқым қуалайтын молекула ретінде әрекет ете алады, бұл Уолтер Гилбертті шалқарыған өткенде жасуша РНҚ-ны генетикалық материал және құрылымдық, каталитикалық молекула ретінде пайдаланғанын ұсынуға итермеледі, қазіргідей ДНК мен белок арасында бұл функцияларды бөлудің орнына; бұл гипотеза өмірдің пайда болуының «РНҚ әлемі гипотезасы» деп белгілі. Нуклеотидтер мен РНҚ (демек, рибозимдер) бейорганикалық химиялық заттардан пайда бола алатындықтан, олар алғашқы ферменттерге үміткер, тіпті алғашқы «көшірмелерге» (яғни, өздерін көшіретін макромолекулаларға) ие. 2002 жылы өзінің нақты көшірмесін жасау үшін екі субстратты байланыстыратын өзін-өзі көшіретін рибозимнің мысалы сипатталды. РНҚ-ның каталитикалық белсенділігін табу өмірдің пайда болуының «тауық пен жұмыртқа» парадоксын шешті, пептидтер мен нуклеин қышқылының пайда болуының мәселесін шешті. Бұл сценарий бойынша, өмірдің пайда болуы кезінде барлық ферменттік белсенділік және генетикалық ақпаратты кодтау бір молекуламен – РНҚ-мен жүзеге асырылды. Зертханада белсендірілген мономерлерден басқа РНҚ молекулаларын синтездеуге қабілетті рибозимдер жасалды, бұл молекулалар РНҚ полимераза рибозимдері деп аталады. Алғашқы РНҚ полимераза рибозимі 1996 жылы хабарланды және 6 нуклеотидке дейін РНҚ полимерлерін синтездеуге қабілетті болды. РНК лигаза рибозиміндегі мутагенез және іріктеу үлкен мөлшерде кездейсоқ РНҚ тізбектерінен жүргізілді, нәтижесінде 2001 жылы жақсартылған «Round 18» полимераза рибозимі оқшауланды, ол қазір 14 нуклеотидке дейін РНҚ полимерлерін катализдей алады. Round 18 рибозиміне қосымша іріктеу жүргізілгеннен кейін B6.61 рибозимі пайда болды және ол 24 сағат ішінде 20 нуклеотидті праймерге қоса алды, одан кейін оның фосфодиэстерлік байланыстарының ыдырауынан ыдырайды. Рибозимдер РНҚ тізбегін полимерлеу жылдамдығы мицелла ішінде жүргенде айтарлықтай артады. Келесі табылған рибозим – «tC19Z» рибозимі, ол 0,0083 мутация/нуклеотид сенімділігімен 95 нуклеотидке дейін қоса алады. Содан кейін зерттеушілер «tC9Y» рибозимін тапты және бұдан әрі 206 нуклеотидке дейінгі РНҚ тізбектерін эвтектикалық фаза жағдайында нөлден төмен температурада синтездей алды, бұл жағдай бұрын рибозим полимераза белсенділігін арттырады екені көрсетілген. tC9 4M деп аталатын РНҚ полимераза рибозимі (РПР) өзінен ұзын (яғни 177 нұклеотидтен ұзын) РНҚ тізбектерін физиологиялық деңгейге жақын магний иондары концентрациясында полимерлендіре алды, ал бұрынғы РПР үшін 200 мМ-ге дейін пребиотикалық тұрғыдан мүмкін емес концентрация қажет болды. Бұл үшін оған лизин декапептиді деп аталатын өте қарапайым аминқышқылының полимері қажет болды. Осы уақытқа дейін синтезделген ең күрделі RPR 24 3 деп аталды, ол жаңадан нуклеотидтік тізбектің көптеген түрлерін полимерлендіруге және бұрынғы рибозимдерге қолжетімді емес РНҚ субстраттарының күрделі екінші құрылымдары арқылы өтуге қабілетті болды. Бұл экспериментте алғаш рет рибозимді тРНҚ молекуласын синтездеу үшін қолданды. 24 3 рибозимінен бастап, Tjhung және басқалар «38 6» деп аталатын, күрделі РНҚ молекулаларын көшіруде бұрын-соңды болмаған белсенділік деңгейі бар РНҚ полимераза рибозимін алу үшін іріктеудің тағы он төрт кезеңін қолданды. Алайда, бұл рибозим өзін-өзі көшіре алмайды және оның РНҚ өнімдерінің мутациялану жылдамдығы жоғары. Келесі зерттеуде зерттеушілер 38 6 рибозимінен бастады және «52 2» рибозимін жасау үшін тағы 14 іріктеу кезеңін қолданды, ол 38 6-ға қарағанда, тағы да көптеген рет белсенді болды және I класты лигазаның анықталатын және функционалдық деңгейін шығара бастады, бірақ ол әлі де T7 РНҚ полимеразасы сияқты ақуыздармен бірдей үлгіні көшірумен салыстырғанда сенімділігі мен функционалдылығы шектеулі болды. t5(+1) деп аталатын RPR бір мезгілде тек бір нуклеотидтің орнына үш нуклеотидті қосады. Бұл гетеродимерлік RPR 24 3-ке қолжетімді емес екінші құрылымдарды, соның ішінде шашты тістелерді де, басқара алады. РНҚ-ның бастапқы түрлерінің тобынан тек бұрын синтезделген РПР-дан алынған, Z РПР деп аталатын екі тізбек жеке пайда болды және бір-біріне өзара тәуелді болып дамыды. 1-түрлі РНҚ каталитикалық белсенді емес болып дамыды, бірақ 5-түрлі РНҚ-мен кешендеу оның полимерлендіру қабілетін арттырды және РНҚ шаблоны субстратымен молекулааралық өзара әрекеттесуді қамтамасыз етті, бұл шаблонды тікелей РНҚ тізбегіне...

RNA can also act as a hereditary molecule, which encouraged Walter Gilbert to propose that in the distant past, the cell used RNA as both the genetic material and the structural and catalytic molecule rather than dividing these functions between DNA and protein as they are today; this hypothesis is known as the "RNA world hypothesis" of the origin of life. Since nucleotides and RNA (and thus ribozymes) can arise by inorganic chemicals, they are candidates for the first enzymes, and in fact, the first "replicators" (i. e., information containing macro molecules that replicate themselves). An example of a self replicating ribozyme that ligates two substrates to generate an exact copy of itself was described in 2002. The discovery of the catalytic activity of RNA solved the "chicken and egg" paradox of the origin of life, solving the problem of origin of peptide and nucleic acid central dogma. According to this scenario, at the origin of life, all enzymatic activity and genetic information encoding was done by one molecule: RNA. Ribozymes have been produced in the laboratory that are capable of catalyzing the synthesis of other RNA molecules from activated monomers under very specific conditions, these molecules being known as RNA polymerase ribozymes. The first RNA polymerase ribozyme was reported in 1996, and was capable of synthesizing RNA polymers up to 6 nucleotides in length. Mutagenesis and selection has been performed on an RNA ligase ribozyme from a large pool of random RNA sequences, resulting in isolation of the improved "Round 18" polymerase ribozyme in 2001 which could catalyze RNA polymers now up to 14 nucleotides in length. Upon application of further selection on the Round 18 ribozyme, the B6.61 ribozyme was generated and was able to add up to 20 nucleotides to a primer template in 24 hours, until it decomposes by cleavage of its phosphodiester bonds. The rate at which ribozymes can polymerize an RNA sequence multiples substantially when it takes place within a micelle. The next ribozyme discovered was the "tC19Z" ribozyme, which can add up to 95 nucleotides with a fidelity of 0.0083 mutations/nucleotide. Next, the "tC9Y" ribozyme was discovered by researchers and was further able to synthesize RNA strands up to 206 nucleotides long in the eutectic phase conditions at below zero temperature, conditions previously shown to promote ribozyme polymerase activity. The RNA polymerase ribozyme (RPR) called tC9 4M was able to polymerize RNA chains longer than itself (i. e. longer than 177 nt) in magnesium ion concentrations close to physiological levels, whereas earlier RPRs required prebiotically implausible concentrations of up to 200 mM. The only factor required for it to achieve this was the presence of a very simple amino acid polymer called lysine decapeptide. The most complex RPR synthesized by that point was called 24 3, which was newly capable of polymerizing the sequences of a substantial variety of nucleotide sequences and navigating through complex secondary structures of RNA substrates inaccessible to previous ribozymes. In fact, this experiment was the first to use a ribozyme to synthesize a tRNA molecule. Starting with the 24 3 ribozyme, Tjhung et al. applied another fourteen rounds of selection to obtain an RNA polymerase ribozyme by in vitro evolution termed '38 6' that has an unprecedented level of activity in copying complex RNA molecules. However, this ribozyme is unable to copy itself and its RNA products have a high mutation rate. In a subsequent study, the researchers began with the 38 6 ribozyme and applied another 14 rounds of selection to generate the '52 2' ribozyme, which compared to 38 6, was again many times more active and could begin generating detectable and functional levels of the class I ligase, although it was still limited in its fidelity and functionality in comparison to copying of the same template by proteins such as the T7 RNA polymerase. An RPR called t5(+1) adds triplet nucleotides at a time instead of just one nucleotide at a time. This heterodimeric RPR can navigate secondary structures inaccessible to 24 3, including hairpins. In the initial pool of RNA variants derived only from a previously synthesized RPR known as the Z RPR, two sequences separately emerged and evolved to be mutualistically dependent on each other. The Type 1 RNA evolved to be catalytically inactive, but complexing with the Type 5 RNA boosted its polymerization ability and enabled intermolecular interactions with the RNA template substrate obviating the need to tether the template directly to the RNA sequence of the RPR, which was a limitation of earlier studies. Not only did t5(+1) not need tethering to the template, but a primer was not needed either as t5(+1) had the ability to polymerize a template in both 3' → 5' and 5' 3 → 3' directions. A highly evolved RNA polymerase ribozyme was able to function as a reverse transcriptase, that is, it can synthesize a DNA copy using an RNA template. Such an activity is considered to have been crucial for the transition from RNA to DNA genomes during the early history of life on earth. Reverse transcription capability could have arisen as a secondary function of an early RNA dependent RNA polymerase ribozyme. An RNA sequence that folds into a ribozyme is capable of invading duplexed RNA, rearranging into an open holopolymerase complex, and then searching for a specific RNA promoter sequence, and upon recognition rearrange again into a processive form that polymerizes a complementary strand of the sequence. This ribozyme is capable of extending duplexed RNA by up to 107 nucleotides, and does so without needing to tether the sequence being polymerized.

Жасанды рибозимдер

Тірі организмдерде рибозимдердің табылуынан бері, зертханада жасалған жаңа синтетикалық рибозимдерді зерттеуге қызығушылық артты. Мысалы, жақсы ферменттік активтілігі бар, жасанды түрде өзін-өзі кесетін РНК-лар жасалды. Танг пен Брейкер, кездейсоқ тізбектерден алынған РНК-ны in vitro іріктеу арқылы өзін-өзі кесетін РНК-ларды оқшаулады. Өндірілген синтетикалық рибозимдердің кейбіреулері жаңа құрылымдарға ие болды, ал кейбіреулері табиғи түрде кездесетін «шекеш басындағы» рибозимге ұқсас болды. 2015 жылы Норт-Уэстерн университеті мен Чикаго Иллинойс университетінің ғалымдары тігілген рибосоманы жасады. Бұл жасанды рибосома, жасушадағы барлық ақуыздар мен ферменттерді өндіретін жасушалық компонент сияқты тиімді жұмыс істейді. Рибосома T, немесе Ribo T деп аталған жасанды рибосоманы Майкл Джуетт пен Александр Манкин жасады. Жасанды рибозимдерді жасауға қолданылатын әдістер бағытталған эволюцияны қамтиды. Бұл тәсіл РНК-ның катализатор және ақпараттық полимер ретіндегі екі жақты табиғатын пайдаланады, бұл зерттеушіге полимераза ферменттерін қолдана отырып, РНК катализаторларының кең ауқымын өндіруді жеңілдетеді. Рибозимдер кері транскрипция арқылы әртүрлі кДНҚ-ға айналдырылып, қатеге ұшыраған ПТР арқылы күшейтіледі. Бұл тәжірибелердегі таңдау параметрлері көбінесе әртүрлі болады. Лигаза рибозимін таңдаудың бір жолы – субстратқа ковалентті байланысқан биотиндік таңбаларды пайдалану. Егер молекулада қажетті лигаза активтілігі болса, активті молекулаларды қалпына келтіру үшін стрептавидин матрицасын қолдануға болады. Линкольн мен Джойс in vitro эволюцияны қолданып, алдын ала синтезделген, өте толықтырғыш олигонуклеотидтерді біріктіру арқылы шамамен бір сағат ішінде өзін-өзі көбейтуге қабілетті рибозим лигазаларын жасады. Шын катализаторлар болмаса да, өзін-өзі кесетін, аптазимдер деп аталатын жасанды рибоауыспарларды жасау да белсенді зерттеу саласы болып табылады. Рибоауыспарлар – бұл трансляцияны реттеу үшін шағын молекулалық лигандқа жауап ретінде құрылымын өзгертетін РНК-ның реттеуші мотивтері. Көптеген метаболиттер мен басқа да шағын органикалық молекулаларды байланыстыратын көптеген белгілі табиғи рибоауыспарлар бар, бірақ рибоауыспарға негізделген тек бір рибозим сипатталған: glmS. Өзін-өзі кесетін рибоауыспарларды сипаттаудың алғашқы жұмыстары лиганд ретінде теофиллинді пайдалануға бағытталған. Бұл зерттеулерде рибосоманың байланыс орнын бұғаттайтын, соның салдарынан трансляцияны тежейтін РНК шаштық құрылымы пайда болады. Лигандтың, осы жағдайда теофиллиннің қатысуымен, реттеуші РНК аймағы кесіліп, рибосоманың мақсатты генге байланысып, трансляциялауына мүмкіндік береді. Бұл РНК инженерлік жұмыстарының көп бөлігі жоғарыда келтірілген мысалдардағыдай, бағытталған эволюция емес, рационалды жобалауға және бұрын анықталған РНК құрылымдарына негізделген. Жақындағы зерттеулер рибозимді рибоауыспарларда қолданылатын лигандтарды тимин пирофосфатын қосуға дейін кеңейтті. Аптазимдерді жасау үшін флуоресценциямен белсендірілген жасушаларды сұрыптау да қолданылған.

Since the discovery of ribozymes that exist in living organisms, there has been interest in the study of new synthetic ribozymes made in the laboratory. For example, artificially produced self cleaving RNAs with good enzymatic activity have been produced. Tang and Breaker isolated self cleaving RNAs by in vitro selection of RNAs originating from random sequence RNAs. Some of the synthetic ribozymes that were produced had novel structures, while some were similar to the naturally occurring hammerhead ribozyme. In 2015, researchers at Northwestern University and the University of Illinois Chicago engineered a tethered ribosome that works nearly as well as the authentic cellular component that produces all the proteins and enzymes within the cell. Called Ribosome T, or Ribo T, the artificial ribosome was created by Michael Jewett and Alexander Mankin. The techniques used to create artificial ribozymes involve directed evolution. This approach takes advantage of RNA's dual nature as both a catalyst and an informational polymer, making it easy for an investigator to produce vast populations of RNA catalysts using polymerase enzymes. The ribozymes are mutated by reverse transcribing them with reverse transcriptase into various cDNA and amplified with error prone PCR. The selection parameters in these experiments often differ. One approach for selecting a ligase ribozyme involves using biotin tags, which are covalently linked to the substrate. If a molecule possesses the desired ligase activity, a streptavidin matrix can be used to recover the active molecules. Lincoln and Joyce used in vitro evolution to develop ribozyme ligases capable of self replication in about an hour, via the joining of pre synthesized highly complementary oligonucleotides. Although not true catalysts, the creation of artificial self cleaving riboswitches, termed aptazymes, has also been an active area of research. Riboswitches are regulatory RNA motifs that change their structure in response to a small molecule ligand to regulate translation. While there are many known natural riboswitches that bind a wide array of metabolites and other small organic molecules, only one ribozyme based on a riboswitch has been described: glmS. Early work in characterizing self cleaving riboswitches was focused on using theophylline as the ligand. In these studies, an RNA hairpin is formed which blocks the ribosome binding site, thus inhibiting translation. In the presence of the ligand, in these cases theophylline, the regulatory RNA region is cleaved off, allowing the ribosome to bind and translate the target gene. Much of this RNA engineering work was based on rational design and previously determined RNA structures rather than directed evolution as in the above examples. More recent work has broadened the ligands used in ribozyme riboswitches to include thymine pyrophosphate. Fluorescence activated cell sorting has also been used to engineering aptazymes.

Қолданбалар

Рибозимдер гендік терапия арқылы ауруларды емдеу үшін ұсынылып, дамытылды. РНК-ға негізделген ферменттерді терапиялық мақсатта қолданудың басты қиындығы – организмдегі катализдік РНК молекулаларының қысқа өмір сүру мерзімі. Бұл мәселені шешу үшін рибозаның 2’ позициясы РНК тұрақтылығын арттыру мақсатында модификацияланады. Рибозимдік гендік терапияның бір саласы РНК-ға негізделген вирустарды тежеу болып табылады. ВИЧ РНК-сына қарсы бағытталған синтетикалық рибозимнің "генді кесу" деп аталатын түрі жасалған және ВИЧ инфекциясымен күресу үшін клиникалық сынақтардан өтуде. Сол сияқты, рибозимдер гепатит С вирусының РНК-сын, SARS коронавирусын (SARS CoV) және аденовирусты жоюға бағытталған. Зерттеушілердің барлық күш-жігеріне қарамастан, бұл жобалар әлі де клиникаға дейінгі сатыда қалып отыр.