Меселсон-Сталь эксперименті және ДНК көшірмесінің механизмі

Кіріспе

1958 жылғы ДНК репликациясы бойынша эксперимент.

Меселсон-Сталл эксперименті – 1958 жылы Мэтью Меселсон мен Фрэнклин Сталл жүргізген эксперимент. Бұл эксперимент Ватсон мен Криктің ДНК репликациясы жартылай сақталушы (жартылай консервативті) деген гипотезасын растады. Жартылай сақталушы репликацияда, екі тізбекті ДНК спиралі көшірілген кезде, екі жаңа екі тізбекті ДНК спиралінің әрқайсысы бастапқы спиральден бір тізбек пен жаңадан синтезделген бір тізбектен тұрады. Бұл эксперимент «биологиядағы ең көркем тәжірибе» деп аталды. Меселсон мен Сталл ата-ана ДНК-ны қадағалаудың ең жақсы жолы – оның бір атомын өзгертіп, белгілеу екенін анықтады. Азот барлық ДНК негіздерінде кездесетіндіктен, олар табиғатта кездесетін азот изотопынан ауыррақ изотопты қамтитын ата-ана ДНК-ны жасады. Бұл өзгерген масса оларға репликацияның кезекті циклдарынан кейін ата-ана ДНК-ның қанша бөлігі қалғанын анықтауға мүмкіндік берді.

Гипотеза

Бұрын ДНК репликациясының механизмі бойынша үш гипотеза ұсынылған болатын. Уотсон мен Крик ұсынған жартылай сақталу гипотезасында ДНК молекуласының екі тізбегі репликация кезінде бөлінеді. Әрбір тізбек жаңа тізбекті синтездеу үшін қалып ретінде қызмет етеді. Консервативті гипотеза бойынша, бүкіл ДНК молекуласы жаңа молекуланың синтезі үшін қалып ретінде әрекет етеді. Бұл модельге сәйкес, гистон ақуыздары ДНК-ға байланысып, тізбекті айналдырады және нуклеотидтік негіздерді (әдетте ішкі бетін жабатын) сутекті байланысқа ашыққа шығарады. Дисперсивті гипотеза Макс Дельбрюк ұсынған модельмен мысалға келтіріледі, ол қос спиральдің екі тізбегін ажырату мәселесін әр 10 нуклеотид сайын ДНК тірегін үзу арқылы шешуге тырысады, молекуланы бұрап, ескі тізбекті жаңа синтезделген тізбектің соңына қосады. Бұл ДНК-ны қысқа бөліктерге, бір тізбектен екіншісіне кезектестіре синтездейді. Осы үш модельдің әрқайсысы репликациядан кейін түзілген молекулалардағы "ескі" ДНК-ның таралуы туралы әртүрлі болжамдар жасайды. Консервативті гипотеза бойынша, репликациядан кейін бір молекула толығымен сақталған "ескі" молекула, ал екіншісі – толығымен жаңа синтезделген ДНК болады. Жартылай сақталу гипотезасы репликациядан кейін әрбір молекулада бір ескі және бір жаңа тізбек болады деп болжайды. Дисперсивті модель әрбір жаңа молекуланың әрбір тізбегінде ескі және жаңа ДНК қоспасы болады деп болжайды.

Тәжірибелік процедура және нәтижелер

Азот ДНК-ның маңызды құрамдас бөлігі болып табылады. 14N – азоттың ең көп таралған изотопы, бірақ ауыррақ (бірақ радиоактивті емес) 15N изотопы бар ДНК да функционалды. E. coli бірнеше буын бойы 15N-мен NH4Cl бар ортада өсірілді. Осы жасушалардан ДНК-ны бөліп алып, тұз (CsCl) тығыздық градиентіне центрифугалағанда, ДНК-ның тығыздығы тұз ерітіндісінің тығыздығымен тең болатын нүктеде бөлінеді. 15N ортада өсірілген жасушалардың ДНК-сы, қалыпты 14N ортада өсірілген жасушалардың ДНК-сынан жоғары тығыздыққа ие болды. Содан кейін, ДНК-сында тек 15N бар E. coli жасушалары 14N ортасына ауыстырылып, бөлінуіне мүмкіндік берілді; жасушалардың бөліну прогресі микроскоп арқылы жасушаларды санау және колониялық талдау арқылы бақыланды. ДНК мерзімді түрде бөліп алып, таза 14N және 15N ДНК-мен салыстырылды. Бір репликациядан кейін ДНК-ның тығыздығы аралық екені анықталды. Консервативті репликация жоғары және төмен тығыздықтағы ДНК-ның тең мөлшерін (бірақ аралық тығыздықтағы ДНК-ны емес) тудыратындықтан, консервативті репликация жобасы алынып тасталды. Дегенмен, бұл нәтиже жартылай консервативті және дисперсивті репликациялармен де сәйкес келеді. Жартылай консервативті репликацияда 15N ДНК-ның бір және 14N ДНК-ның бір тізбегі бар екі тізбекті ДНК түзіледі, ал дисперсивті репликацияда екі тізбекте де 15N және 14N ДНК қоспалары бар екі тізбекті ДНК түзіледі, олардың екеуі де аралық тығыздықтағы ДНК ретінде көрінеді. Авторлар репликация жалғасып жатқанда жасушалардан үлгі алуды жалғастырды. Екі репликация аяқталғаннан кейін жасушалардан алынған ДНК екі түрлі тығыздықтағы тең мөлшердегі ДНК-дан тұрады: біреуі 14N ортасында бір бөліну үшін өсірілген жасушалардың ДНК-сының аралық тығыздығына, екіншісі – тек 14N ортасында өсірілген жасушалардың ДНК-сына сәйкес келеді. Бұл дисперсивті репликациямен сәйкес келмейді, себебі дисперсивті репликацияда бір тығыздық болуы керек еді, ол бір буын жасушаларының аралық тығыздығынан төмен, бірақ 14N ДНК ортасында өсірілген жасушалардан жоғары болар еді, өйткені бастапқы 15N ДНК барлық ДНК тізбектері арасында тең бөлінер еді. Нәтиже жартылай консервативті репликация гипотезасымен сәйкес келеді.

Nitrogen is a major constituent of DNA. 14N is by far the most abundant isotope of nitrogen, but DNA with the heavier (but non radioactive) 15N isotope is also functional. E. coli was grown for several generations in a medium containing NH4Cl with 15N. When DNA is extracted from these cells and centrifuged on a salt (CsCl) density gradient, the DNA separates out at the point at which its density equals that of the salt solution. The DNA of the cells grown in 15N medium had a higher density than cells grown in normal 14N medium. After that, E. coli cells with only 15N in their DNA were transferred to a 14N medium and were allowed to divide; the progress of cell division was monitored by microscopic cell counts and by colony assay. DNA was extracted periodically and was compared to pure 14N DNA and 15N DNA. After one replication, the DNA was found to have intermediate density. Since conservative replication would result in equal amounts of DNA of the higher and lower densities (but no DNA of an intermediate density), conservative replication was excluded. However, this result was consistent with both semiconservative and dispersive replication. Semiconservative replication would result in double stranded DNA with one strand of 15N DNA, and one of 14N DNA, while dispersive replication would result in double stranded DNA with both strands having mixtures of 15N and 14N DNA, either of which would have appeared as DNA of an intermediate density. The authors continued to sample cells as replication continued. DNA from cells after two replications had been completed was found to consist of equal amounts of DNA with two different densities, one corresponding to the intermediate density of DNA of cells grown for only one division in 14N medium, the other corresponding to DNA from cells grown exclusively in 14N medium. This was inconsistent with dispersive replication, which would have resulted in a single density, lower than the intermediate density of the one generation cells, but still higher than cells grown only in 14N DNA medium, as the original 15N DNA would have been split evenly among all DNA strands. The result was consistent with the semiconservative replication hypothesis.