Введение

Эксперимент 1958 года по репликации ДНК. Эксперимент Мезелсона — Сталя, проведенный Мэтью Мезелсоном и Франклином Сталем в 1958 году, подтвердил гипотезу Уотсона и Крика о полуконсервативном механизме репликации ДНК. При полуконсервативной репликации, когда происходит удвоение двухцепочечной спирали ДНК, каждая из двух новых двухцепочечных спиралей ДНК состоит из одной цепи исходной спирали и одной вновь синтезированной цепи. Этот эксперимент называют «самым красивым экспериментом в биологии». Мезелсон и Сталь решили, что лучший способ проследить за родительской ДНК — пометить её, заменив один из атомов в её составе. Поскольку азот входит в состав всех азотистых оснований ДНК, они создали родительскую ДНК, содержащую более тяжелый изотоп азота, чем обычно встречается в природе. Изменение массы позволило им определить, какая часть родительской ДНК сохраняется после каждого цикла репликации.

Гипотеза

Ранее было предложено три гипотезы относительно механизма репликации ДНК. В полуконсервативной гипотезе, предложенной Уотсоном и Криком, две цепи молекулы ДНК разделяются во время репликации. Каждая цепь затем служит матрицей для синтеза новой цепи. Консервативная гипотеза предполагала, что вся молекула ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза совершенно новой молекулы. Согласно этой модели, гистонные белки связываются с ДНК, обвиваясь вокруг цепи и обнажая нуклеотидные основания (которые обычно расположены внутри) для образования водородных связей. Дисперсивная гипотеза иллюстрируется моделью, предложенной Максом Дельбрюком, которая пытается решить проблему раскручивания двух цепей двойной спирали посредством механизма, разрывающего фосфодиэфирную связь ДНК примерно каждые 10 нуклеотидов, раскручивающего молекулу и присоединяющего старую цепь к концу вновь синтезированной. Это привело бы к синтезу ДНК короткими фрагментами, чередующимися от одной цепи к другой. Каждая из этих трех моделей делает различные предсказания относительно распределения "старой" ДНК в молекулах, образовавшихся после репликации. В консервативной гипотезе после репликации одна молекула является полностью сохраненной "старой" молекулой, а другая – полностью вновь синтезированной ДНК. Полуконсервативная гипотеза предсказывает, что каждая молекула после репликации будет содержать одну старую и одну новую цепь. Дисперсивная модель предсказывает, что каждая цепь каждой новой молекулы будет содержать смесь старой и новой ДНК.

Экспериментальная процедура и результаты

Азот является основным компонентом ДНК. 14N является наиболее распространенным изотопом азота, но ДНК с более тяжелым (но не радиоактивным) изотопом 15N также функциональна. E. coli выращивали в течение нескольких поколений в среде, содержащей NH4Cl с 15N. Когда ДНК извлекается из этих клеток и центрифугируется в градиенте плотности соли (CsCl), ДНК разделяется в точке, где ее плотность равна плотности солевого раствора. ДНК клеток, выращенных в среде с 15N, имела более высокую плотность, чем ДНК клеток, выращенных в обычной среде с 14N. Затем клетки E. coli, содержащие только 15N в своей ДНК, были перенесены в среду с 14N и разрешено делиться; прогресс клеточного деления контролировался микроскопическим подсчетом клеток и методом колоний. ДНК периодически извлекалась и сравнивалась с чистой ДНК 14N и 15N. После одной репликации было обнаружено, что ДНК имеет промежуточную плотность. Поскольку консервативная репликация привела бы к равным количествам ДНК с высокой и низкой плотностью (но не ДНК с промежуточной плотностью), консервативная репликация была исключена. Однако этот результат соответствовал как полуконсервативной, так и дисперсной репликации. Полуконсервативная репликация привела бы к образованию двухцепочечной ДНК, состоящей из одной цепи 15N ДНК и одной цепи 14N ДНК, в то время как дисперсивная репликация привела бы к образованию двухцепочечной ДНК, в обеих цепях которой содержались бы смеси 15N и 14N ДНК, и каждая из них выглядела бы как ДНК с промежуточной плотностью. Авторы продолжали брать пробы клеток по мере продолжения репликации. ДНК клеток после завершения двух репликаций состояла из равных количеств ДНК с двумя различными плотностями: одна соответствовала промежуточной плотности ДНК клеток, выращенных в среде 14N только в течение одного деления, а другая – ДНК клеток, выращенных исключительно в среде 14N. Это противоречило дисперсивной репликации, которая привела бы к единой плотности, ниже, чем промежуточная плотность клеток первого поколения, но все же выше, чем у клеток, выращенных только в среде 14N, поскольку исходная ДНК 15N была бы равномерно распределена между всеми цепями ДНК. Результат соответствовал гипотезе полуконсервативной репликации.