Кіріспе

GTP-ге байланысатын ақуыздар клеткалық циклді реттеуде қатысады. p21/Ras ақуызы

Ras, "Егез саркома вирусынан" шыққан, барлық жануарлар жасушалары мен мүшелерінде кездесетін ақуыздар тобы. Ras ақуыздар отбасының барлық мүшелері кішкентай GTPаза ақуыздар класына жатады және жасуша ішіндегі сигналдарды жеткізуге (жасушалық сигнал трандукциясы) қатысады. Ras – Ras ақуыздар суперавтобасының негізгі өкілі, олардың барлығы үш өлшемді құрылымы бойынша байланысты және жасушалардың әртүрлі мінез-құлқына әсер етеді. Ras кіріс сигналдармен "қосылғанда", ол басқа ақуыздарды қосып, клетканың өсуіне, дифференциациялануына және тірі қалуына қатысатын гендерді белсендіреді. Ras гендеріндегі мутациялар тұрақты түрде белсенді Ras ақуыздарын құруға алып келуі мүмкін, бұл кіріс сигналдардың болмауына қарамастан, жасуша ішінде бақыланбайтын және жоғары белсенділіктегі сигнал беруге себеп болады. Осы сигналдар жасушаның өсуіне және бөлінуіне ықпал етеді, сондықтан Ras сигналдауының жоғары белсенділігі қатерлі ісікке әкелуі мүмкін. Адамдағы үш Ras гені (HRAS, KRAS және NRAS) – адам қатерлі ісігінде ең көп кездесетін онкогендер; Ras-ті тұрақты түрде белсендіретін мутациялар барлық адам ісіктерінің 20-25%-ында және кейбір қатерлі ісіктердің 90%-ында (мысалы, бүйрек безінің қатерлі ісігі) табылады. Осы себепті, Ras ингибиторлары қатерлі ісік және Ras-тің жоғары экспрессиясымен байланысты басқа да ауруларды емдеу үшін зерттелуде.

Тарих

Бірінші екі Ras гені, HRAS және KRAS, Эдвард М. Скольник және Ұлттық денсаулық сақтау институтының (NIH) әріптестері Харви саркома вирусы мен Кирстен саркома вирусын зерттеу барысында анықталды. Бұл вирустар алғашқыда 1960 жылдары Женнифер Харви мен Вернер Х. Кирстен тарапынан егеуқұйрықтарда (rats) табылды, сол себепті оларға "егеуқұйрық саркомасы" деген ат берілді. Мариано Барбасид және Стюарт А. Аронсон (NIH), Роберт Вайнберг (MIT) және Майкл Виглер (Cold Spring Harbor зертханасы) осы зерттеулерге қатысты. Кейіннен, Рак зерттеу институтындағы Робин Вайс тобы мен Cold Spring Harbor зертханасындағы Майкл Виглер адам нейробластома жасушаларында алғаш рет анықталғаны үшін NRAS деп аталған үшінші ras генін тапты. Адамның үш ras гені де 188-ден 189-ға дейін аминқышқылдарынан тұратын өте ұқсас ақуыздарды кодтайды. Олардың гендік белгілері HRAS, NRAS және KRAS болып табылады, соңғысы альтернативті тіліну (alternative splicing) арқылы K Ras4A және K Ras4B изоформаларын шығарады.

Құрылымы

Ras құрамында алты бета жіп және бес альфа спираль бар. Ол екі доменнен тұрады: гуанозин нуклеотидтерін байланыстыратын 166 аминқышқылынан тұратын G домені (шамамен 20 кДа) және фарнезил трансфераза, RCE1 және ICMT арқылы липидтік модификацияланатын C терминалды мембранаға бағытталған аймақ (CAAX COOH, сондай-ақ CAAX қорап деп те аталады). G домені GDP/GTP тікелей байланыстыратын бес G мотивін қамтиды. G1 мотиві немесе P циклы GDP және GTP-нің бета-фосфатын байланыстырады. G2 мотиві, сондай-ақ Switch I немесе SW1 деп аталады, GTP-нің терминалды фосфатымен (γ фосфаты) және белсенді ортада байланысқан дивалентті магний ионымен байланыстыратын треонин35 қамтиды. G3 мотиві, сондай-ақ Switch II немесе SW2 деп аталады, DXXGQ мотивіне ие. D – аспартат57, ол гуанинге қарағанда аденинмен байланысуға тән, ал Q – глутамин61, GTP-ді GDP-ге гидролиздеу үшін катализдік су молекуласын белсендіретін маңызды қалдық. G4 мотиві LVGNKxDL мотивін қамтиды және гуанинмен ерекше өзара әрекеттеседі. G5 мотиві SAK консенсустық тізбегін қамтиды. А – аланин146, ол аденин емес, гуанинке ерекшелік береді. G2 (SW1) және G3 (SW2) екі ауыстырғыш мотиві – GTP GDP-ге гидролизденгенде қозғалатын белоктың негізгі бөліктері. Осы екі ауыстырғыш мотивтің конформациялық өзгеруі молекулалық ауыстырғыш ақуыз ретінде негізгі функционалдылықты қамтамасыз етеді. Ras-тің GTP байланысқан күйі – «қосылған» күй, ал GDP байланысқан күйі – «өшірілген» күй. Екі ауыстырғыш мотиві GTP немесе GDP байланысқанда немесе нуклеотид жоқ кезде (SOS1-ге байланысқанда, ол нуклеотидті босатады) бірнеше конформацияларға ие. Ras сонымен қатар нуклеотид байланысын үйлестіруге көмектесетін магний ионымен байланысады.

Функция

Ras ақуыздары клеткаішілік сигналдық желілерді бақылайтын екілік молекулалық коммутаторлар ретінде жұмыс істейді. Ras реттелетін сигналдық жолдар актин цитоскелетінің тұтастығы, жасушалардың көбеюі, жасушалардың дифференциациялануы, жасушалардың жабысуы, апоптоз және жасушалардың қозғалуы сияқты процестерді басқарады. Ras және Ras-қа қатысты ақуыздар қатерлі ісіктерде жиі бұзылады, бұл инвазия мен метастаздың күшеюіне және апоптоздың азаюына алып келеді. Ras бірнеше жолды белсендіреді, олардың ішінде митогенге жауап беретін белок (MAP) киназа каскады жақсы зерттелген. Бұл каскад сигналдарды төмен қарай жеткізеді және жасушаның өсуі мен бөлінуіне қатысты гендердің транскрипциясына әкеледі. Ras белсендіретін тағы бір сигналдық жол – PI3K/AKT/mTOR жолы, ол ақуыз синтезін және жасушалық өсуді күшейтеді және апоптозды тежейді.

Белсенділенуі және өшірілуі

Ras – гуанозин нуклеотидтерін байланыстыратын ақуыз. Нақтырақ айтқанда, ол бір ғана кіші ГТФазаның құрылымдық бөлігі, және гетеротрімерлі G-ақуыздарының (ірі ГТФазалардың) Gα- кіші бөлігімен құрылымдық байланыста болады. G-ақуыздары «қосылған» және «өшірілген» күйлердегі екілік сигнал беру коммутаторлары ретінде жұмыс істейді. «Өшірілген» күйде ол гуанозин дифосфатымен (ЖДФ) байланысады, ал «қосылған» күйде Ras гуанозин трифосфатымен (ГТФ) байланысады, ол ЖДФ-қа қарағанда қосымша фосфат тобына ие. Бұл қосымша фосфат екі ауыстыру аймағын «керілген серіппе» конфигурациясында (нақтырақ айтқанда Thr 35 және Gly 60) ұстап тұрады. Босатылған кезде ауыстыру аймақтары босаңсып, конформациялық өзгеріске алып келеді, нәтижесінде белсенді емес күйге енеді. Осылайша, Ras және басқа да кіші G-ақуыздардың белсендірілуі мен өшірілуі белсенді ГТФ-мен және белсенді емес ЖДФ-мен байланысқан формалар арасындағы циклмен бақыланады. Байланысқан нуклеотидті алмастыру процесін гуанин нуклеотидтік алмасу факторлары (GEF) және ГТФазаны белсендіретін ақуыздар (GAP) жеңілдетеді. Классификациясы бойынша, Ras ішкі ГТФаза активтілігіне ие, яғни ақуыз өзі байланысқан ГТФ молекуласын ЖДФ-қа гидролиздей алады. Алайда, бұл процесс тиімді жұмыс істеу үшін тым баяу, сондықтан Ras үшін GAP, RasGAP, Ras-тің катализдік механизміне байланысып, тұрақтандыруға қабілетті, сондай-ақ қосымша катализдік қалдықтарды («аргинин саусағы») қамтамасыз етеді, осылайша су молекуласы ГТФ-тың гамма-фосфатына нуклеофильді шабуыл жасау үшін оңтайлы жағдайда орналасады. Органикалық емес фосфат бөлінеді және Ras молекуласы енді ЖДФ-қа байланысады. ЖДФ-қа байланысқан форма сигнализация үшін «өшірілген» немесе «белсенді емес» болғандықтан, ГТФазаны белсендіретін ақуыз (GAP) Ras-тің ГТФаза активтілігін белсендіре отырып, инактивациялайды. Осылайша, GAP Ras-тің инактивациясын үдетеді. GEF «итеру және тарту» реакциясын катализдейді, ол Ras-тан ЖДФ-ты босатады. Олар P цикліне және магний катионының байланысу орнына жақын орналасып, олардың гамма-фосфат анионымен өзара әрекеттесуін тежейді. II ауыстырғыштағы қышқыл (теріс) қалдықтар P цикліндегі лизинды ЖДФ-тан «тартып», I ауыстырғышты гуанинден «итереді». ЖДФ-ты орнында ұстап тұрған байланыстар бұзылып, цитоплазмаға шығарылады. Өйткені ұяшық ішіндегі ГТФ ЖДФ-қа қарағанда көп (шамамен 10 есе көп), бұл цикл NRAS және HRAS-тың уақыт өте келе басқа мембраналарға ағып кетуін болдырмайды және олардың Гольджи аппараты, секреторлық жол, плазмалық мембрана және өзара байланысты эндоцитоз жолы бойындағы тұрақты локализациясын сақтайды.

Рас қатерлі ісікте

Протоонкогендердің Ras туысындағы (H Ras, N Ras және K Ras) мутациялары өте жиі кездеседі, адамның барлық ісіктерінің 20%-дан 30%-ында табылады. Ras белсенділігін төмендететін фармакологиялық тәсіл, кейбір қатерлі ісік түрлерін тоқтатудың мүмкін болатын жолы болуы мүмкін деп болжауға болады. Ras нүктелік мутациялары – адам протоонкогендерінің ең көп таралған бұзылысы. Ras ингибиторы транс-фарнезилтиосалицил қышқылы (FTS, Salirasib) көптеген қатерлі ісік жасушаларының желілерінде күшті антионкогендік әсер көрсетеді.

Қате белсендірілген

Геннің қате белсендірілуі сигналдардың бұзылуына, жасушалардың көбеюіне және қатерлі өзгеріске ұшырауына басты себеп болады.

Құрауыш активті Ras

Құрылыс активті Ras (RasD) – GTP гидролизіне кедергі келтіретін мутацияларды қамтиды, осылайша Ras-ты тұрақты түрде "қосылған" күйде ұстайды. Ең көп кездесетін мутациялар P циклындағы G12 және каталитикалық Q61 қалдықтарында табылады. 12-ші қалдықтағы глициннің валинге мутациясы Ras-тың GTPаза доменін GAP-тың инактивациясына сезімсіз етеді, нәтижесінде ол "қосылған" күйде қалады. Ras-қа инактивация үшін GAP қажет, себебі ол гетеротримерлік G белоктарының альфа-бөлігі сияқты басқа G доменін қамтитын белоктарға қарағанда нашар катализатор болып табылады. 61-ші қалдық GTP гидролизі үшін өтпелі күйді тұрақтандыруға жауапты. Ферменттік катализ, әдетте, субстрат пен өнім арасындағы энергия кедергісін төмендету арқылы жүзеге асырылатындықтан, Q61-ді K-ға (глютаминнен лизинге) мутациялау Ras GTP гидролизінің жылдамдығын физиологиялық маңызы жоқ деңгейге дейін төмендетеді. Сондай-ақ, S17N және D119N сияқты "доминантты теріс" мутанттарды қараңыз.

Растық мақсаттағы қатерлі ісікпен емдеу

Реовирус қатерлі жасушаларда жақсы көбейеді деген зерттеулер көрсеткенде, ол қатерлі ісікке қарсы емдік құрал бола алатыны анықталды. Ол белсенді Ras жолы бар (жасушалық өсу мен дифференциацияға қатысатын жасушалық сигнализация жолы) жасушаларда ерекше көбейеді. Реовирус Ras белсенділігі бар ісіктік жасушаларда көбейіп, соңында оларды өлтіреді, ал жасушалар өлгенде, вирус ұрпақтарының бөлшектері айналасындағы қатерлі жасушаларды жұқтыра алады. Инфекция, көбейіп өсу және жасушалардың өлімі циклы белсенді Ras жолы бар барлық ісіктік жасушалар жойылғанға дейін қайталанады деп есептеледі. Рас жолы белсендірілген ісіктік жасушаларды арнайы нысаналайтын тағы бір ісік лизингтік вирусы – FusOn H2 деп аталатын II типті герпес симплекс вирусына (HSV 2) негізделген агент. Ras ақуызының және Ras ақуызын белсендіретін мутациялардың ағыс бағытындағы элементтері адамның барлық қатерлі ісіктерінің үштен екісінен астамына, соның ішінде метастаздық ауруларға да әсер етуі мүмкін. Реолизин, реовирустың бір құрамы, және FusOn H2 қазіргі уақытта клиникалық сынақтарда немесе әртүрлі қатерлі ісіктерді емдеу үшін әзірленуде. Сонымен қатар, siRNA антимутацияланған K RAS (G12D) негізіндегі siG12D LODER емдігі қазіргі уақытта жергілікті түрде кеңейген бүйрек безінің қатерлі ісігін емдеу үшін клиникалық сынақтардан өтуде (NCT01188785, NCT01676259). Глиобластома егесік моделінде рак ми жасушаларында SHP2 деңгейі жоғары болды. SHP2-ні тежеу Ras дефосфорилирлеуін тежеді. Бұл ісіктің көлемін азайтып, өмір сүру көрсеткіштерін арттырды. Басқа стратегиялар да жоғарыда аталған Ras-тың орналасуын реттеуге тырысты. Фарнезилтрансфераза ингибиторлары Ras-тың фарнезилденуін тоқтату үшін жасалды, осылайша оның мембраналармен байланысу қабілетін әлсіретеді. Мутацияланған Ras молекулаларын табуға жаңа ингибиторлық стратегия сипатталды. Ras мутациялары 12-ші қалдық позициясында реттегіш GAP молекуласының мутацияланған Ras-қа байланысуын тежейді, бұл бақылаусыз жасуша өсуіне әкеледі. Жаңа стратегияда кішкентай "желім" молекулаларын табу ұсынылады, олар мутацияланған Ras-ты GAP-қа жалғап, бақылаусыз жасуша өсуін тоқтатып, қалыпты функцияны қалпына келтіреді. Осы мақсат үшін молекулалар арасында бірнеше Å арақашықтығы бар Ras GAP конформациясы жобаланды және "желімдеуші" агенттерді табу үшін жоғары өнімді кремнийлік докинг жүргізілді. Тұжырымдаманы растау үшін екі жаңа молекуланың қанағаттанарлық биологиялық белсенділігі сипатталды.

Басқа түрлерде

Көптеген түрлердің көптеген жасуша түрлерінде Ras көбінесе GDP түрінде болады. Бұл Xenopus ооциттері мен егеуқұйрықшаның фибробласттары үшін де сәйкес келеді.

Xenopus laevis (қазандық)

Жоғарыда айтылғандай, X. ооциттеріндегі Ras көбінесе ЖДӨ конъюгаты болып табылады. Сүтқоректілердегі Ras, X. laevis ооциттерінде мейозды инсулинмен шақырылған мейозды күшейту арқылы, бірақ прогестеронмен шақырылған мейозды күшейтпейді. Ақуыз синтезі бұл қадамның бір бөлігі сияқты көрінбейді. Инъекция фосфатидилхолиннен диацилглицерол синтезін арттырады. Кейбір мейоз эффектілері rap1 (және бұрыс бекітілген Ras модификациясы) арқылы тежеледі. Rap1 және модификацияланған Ras екеуі де осы жолмен p120Ras GAP-қа қарсы әрекет етеді.

Drosophila melanogaster (Қара шаяндар)

Drosophila melanogaster-дың барлық тіндерінде, бірақ көбінесе жүйке жасушаларында экспрессияланады. Шамадан тыс экспрессия белгілі бір деңгейде өлімге алып келеді және даму кезінде көз бен қанат аномалияларын тудырады. (Бұл рецепторлы тирозинкиназалардың мутациясынан туындайтын ұқсас аномалияларды параллельдеп, олардың себебі болуы мүмкін.) Сүтқоректілердегі rases гендері аномалияларға әкеп соқтырады.

Аплизия

Aplysia spp-дағы көбірек экспрессия нейрондық жасушаларда байқалады.

Caenorhabditis elegans (қаңқа шаяну)

C. elegans-тағы ген let-60 деп аталады. Бұл модельде рецепторлы тирозинкиназаның қалыптасуында да рөл атқарады. Оның артық экспрессиясы осы аймақтың қалыпты дамуына қатысқандықтан көп жатыршалық дамуға (multivulval development) алып келеді; эффекторлық орталықтарда артық экспрессия өлімге әкеледі.

Диктиостелий дискоидеум

Dictyostelium discoideum үшін маңызды. Бұл ras экспрессиясы жеткіліксіз болғанда дамудың қатаң түрде бұзылуымен және жасанды түрде экспрессияланғанда әртүрлі өмірлік қызметтердің айқын түрде нашарлауымен куәландырылады, мысалы: инозитол фосфаттарының концентрациясының артуы; хемотаксис рецепторларына cAMP байланысының ықтимал азаюы; және осының салдарынан cGMP синтезінің бұзылуы мүмкін. Аденила́т циклаза белсенділігіне ras әсер етпейді.