Введение

GTP-связывающие белки, участвующие в регуляции клеточного цикла p21/Ras

Белок Ras, происходящий от "вируса саркомы крысы", представляет собой семейство родственных белков, экспрессирующихся во всех клеточных линиях и органах животных. Все члены семейства белков Ras относятся к классу белков, называемых малыми GTPазами, и участвуют в передаче сигналов внутри клеток (клеточной сигнальной трансдукции). Ras является прототипическим членом суперсемейства белков Ras, которые связаны трехмерной структурой и регулируют разнообразные клеточные процессы. Когда Ras активируется входящими сигналами, он, в свою очередь, активирует другие белки, которые в конечном итоге включают гены, участвующие в росте, дифференцировке и выживании клеток. Мутации в генах Ras могут приводить к образованию постоянно активированных белков Ras, которые могут вызывать нежелательную и чрезмерную передачу сигналов внутри клетки, даже в отсутствие входящих сигналов. Поскольку эти сигналы стимулируют рост и деление клеток, чрезмерная активация сигналов Ras может в конечном итоге привести к раку. Три гена Ras у человека (HRAS, KRAS и NRAS) являются наиболее распространенными онкогенами при раке человека; мутации, приводящие к постоянной активации Ras, обнаруживаются в 20–25% всех опухолей человека и до 90% в определенных типах рака (например, раке поджелудочной железы). По этой причине ингибиторы Ras изучаются как потенциальное средство лечения рака и других заболеваний, связанных с переэкспрессией Ras.

История

Первые два гена Ras, HRAS и KRAS, были идентифицированы в ходе исследований двух вирусов, вызывающих рак – вируса саркомы Харви и вируса саркомы Кирстен – Эдвардом М. Сколником и его коллегами из Национального института здравоохранения (NIH). Эти вирусы были первоначально обнаружены у крыс в 1960-х годах Дженнифер Харви и Вернером Х. Кирстеном, соответственно, что и послужило причиной названия «саркома крыс». Мариано Барбасид и Стюарт А. Ааронсон (NIH), Роберт Вайнберг (MIT) и Майкл Виглер (лаборатория Cold Spring Harbor) внесли вклад в эти исследования. Третий ген ras был впоследствии обнаружен исследователями из группы Робина Вайса в Институте исследований рака и Майкла Виглера в лаборатории Cold Spring Harbor и получил название NRAS, поскольку он был впервые идентифицирован в клетках человеческой нейробластомы. Три человеческих гена ras кодируют чрезвычайно похожие белки, состоящие из цепей из 188–189 аминокислот. Их генные обозначения – HRAS, NRAS и KRAS, последний из которых в результате альтернативного сплайсинга производит изоформы K Ras4A и K Ras4B.

Структура

Ras содержит шесть бета-цепей и пять альфа-спиралей. Он состоит из двух доменов: G-домена из 166 аминокислот (около 20 кДа), который связывает гуанозиннуклеотиды, и C-терминального региона таргетирования на мембрану (CAAX COOH, также известного как CAAX-ящик), который подвергается липидному модифицированию фарнезилтрансферазой, RCE1 и ICMT. G-домен содержит пять G-мотивов, которые непосредственно связывают GDP/GTP. G1-мотив, или P-петля, связывает бета-фосфат GDP и GTP. G2-мотив, также называемый Switch I или SW1, содержит треонин35, который связывает терминальный фосфат (γ-фосфат) GTP и двухвалентный ион магния, связанный в активном центре. G3-мотив, также называемый Switch II или SW2, имеет мотив DXXGQ. D – это аспартат57, который специфичен для связывания гуанина, а не аденина, а Q – глутамин61, ключевой остаток, который активирует каталитическую молекулу воды для гидролиза GTP в GDP. G4-мотив содержит мотив LVGNKxDL и обеспечивает специфическое взаимодействие с гуанином. G5-мотив содержит консенсусную последовательность SAK. A – это аланин146, который обеспечивает специфичность для гуанина, а не аденина. Два переключающих мотива, G2 (SW1) и G3 (SW2), являются основными частями белка, которые изменяют свое положение при гидролизе GTP в GDP. Это конформационное изменение, вызванное двумя переключающими мотивами, опосредует базовую функциональность как молекулярного переключателя. Связанное с GTP состояние Ras является состоянием "включено", а состояние, связанное с GDP, – состоянием "выключено". Два переключающих мотива имеют ряд конформаций при связывании GTP или GDP или при отсутствии нуклеотида (при связывании с SOS1, который высвобождает нуклеотид). Ras также связывает ион магния, который способствует координации связывания нуклеотидов.

Функция

Ras-белки функционируют как бинарные молекулярные переключатели, контролирующие внутриклеточные сигнальные сети. Сигнальные пути, регулируемые Ras, управляют такими процессами, как целостность актинового цитоскелета, пролиферация клеток, дифференцировка клеток, клеточная адгезия, апоптоз и миграция клеток. Ras и белки, связанные с Ras, часто подвергаются дерегуляции при раке, что приводит к увеличению инвазии и метастазирования, а также к снижению апоптоза. Ras активирует несколько сигнальных путей, среди которых хорошо изучен каскад митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK). Этот каскад передает сигналы ниже по потоку и приводит к транскрипции генов, участвующих в росте и делении клеток. Другой сигнальный путь, активируемый Ras, – это PI3K/AKT/mTOR, который стимулирует синтез белка и рост клеток, а также подавляет апоптоз.

Активация и деактивация

Ras — это белок, связывающий нуклеотиды гуанозина. В частности, это малая ГТФаза, состоящая из одной субъединицы, структурно связанная с Gα-субъединицей гетеротримерных белков G (крупные ГТФазы). Белки G функционируют как бинарные сигнальные переключатели с состояниями «включено» и «выключено». В «выключенном» состоянии он связан с нуклеотидом гуанозиндифосфатом (GDP), а в «включенном» состоянии Ras связан с гуанозинтрифосфатом (GTP), который содержит дополнительную фосфатную группу по сравнению с GDP. Эта дополнительная фосфатная группа удерживает две области переключения в конфигурации «натянутой пружины» (в частности, Thr 35 и Gly 60). При высвобождении области переключения расслабляются, что вызывает конформационное изменение в неактивное состояние. Таким образом, активация и деактивация Ras и других малых G-белков контролируются переключением между активной, связанной с GTP, и неактивной, связанной с GDP, формами. Процесс обмена связанных нуклеотидов облегчается факторами обмена нуклеотидов гуанина (GEF) и белками, активирующими ГТФазу (GAP). В соответствии со своей классификацией, Ras обладает собственной ГТФазной активностью, что означает, что сам белок способен гидролизовать связанную молекулу GTP до GDP. Однако этот процесс слишком медленный для эффективной работы, поэтому GAP для Ras, RasGAP, может связываться и стабилизировать каталитический механизм Ras, предоставляя дополнительные каталитические остатки («аргининовый палец»), обеспечивающие оптимальное положение молекулы воды для нуклеофильной атаки на гамма-фосфат GTP. Высвобождается неорганический фосфат, и молекула Ras теперь связана с GDP. Поскольку форма, связанная с GDP, является «выключенной» или «неактивной» для передачи сигналов, белок, активирующий ГТФазу, инактивирует Ras, активируя его ГТФазную активность. Таким образом, GAP ускоряют инактивацию Ras. GEF катализируют реакцию «толкания и вытягивания», которая высвобождает GDP из Ras. Они вставляются вблизи P-петли и места связывания ионов магния и ингибируют взаимодействие этих соединений с гамма-фосфатным анионом. Кислотные (отрицательные) остатки во второй области переключения («switch II») «вытягивают» лизин из P-петли от GDP, что «отталкивает» первую область переключения («switch I») от гуанина. Контакты, удерживающие GDP на месте, разрываются, и он высвобождается в цитоплазму. Поскольку внутриклеточный GTP присутствует в избытке по сравнению с GDP (примерно в 10 раз больше), считается, что этот цикл предотвращает утечку NRAS и HRAS в другие мембраны со временем и поддерживает их стабильную локализацию вдоль аппарата Гольджи, секреторного пути, плазматической мембраны и взаимосвязанного пути эндоцитоза.

Рас в раковых заболеваниях

Мутации в семействе протоонкогенов Ras (включая H Ras, N Ras и K Ras) встречаются очень часто, обнаруживаясь в 20–30% всех человеческих опухолей. Разумно предположить, что фармакологический подход, подавляющий активность Ras, может стать потенциальным методом ингибирования определенных типов рака. Точечные мутации Ras являются наиболее распространенной аномалией среди человеческих протоонкогенов. Ингибитор Ras – транс-фарнезилтиосалициловая кислота (FTS, Salirasib) демонстрирует выраженные противоопухолевые эффекты во многих раковых клеточных линиях.

Неправильная активация

Было показано, что неадекватная активация гена играет ключевую роль в нарушенной передаче сигнала, пролиферации и злокачественном превращении.

Составляющая активная Ras

Конститутивно активный Ras (RasD) – это форма, содержащая мутации, препятствующие гидролизу ГТФ, что удерживает Ras в постоянно активированном состоянии. Наиболее распространенные мутации локализуются в остатке G12 в P-петле и в каталитическом остатке Q61. Мутация глицина на валин в положении 12 делает ГТФазный домен Ras нечувствительным к инактивации GAP и, следовательно, блокирует его в активном состоянии. Ras требует GAP для инактивации, поскольку сам по себе является относительно слабым катализатором, в отличие от других белков, содержащих G-домен, таких как альфа-субъединица гетеротримерных G-белков. Остаток 61 отвечает за стабилизацию переходного состояния при гидролизе ГТФ. Поскольку ферментативный катализ в целом достигается путем снижения энергетического барьера между субстратом и продуктом, мутация Q61 в K (глутамин в лизин) неизбежно снижает скорость собственного гидролиза ГТФ Ras до физиологически незначимых уровней. См. также "доминантные негативные" мутанты, такие как S17N и D119N.

Расовые методы лечения рака

Реовирус был отмечен как потенциальное противораковое средство, когда исследования показали, что он хорошо размножается в определенных раковых клеточных линиях. Он реплицируется специфически в клетках с активированным Ras-путем (клеточный сигнальный путь, участвующий в росте и дифференцировке клеток). Реовирус реплицируется в активированных Ras опухолевых клетках и в конечном итоге их уничтожает, а по мере гибели клеток вирусные частицы-потомки высвобождаются для заражения окружающих раковых клеток. Считается, что этот цикл инфекции, репликации и гибели клеток повторяется до тех пор, пока не будут уничтожены все опухолевые клетки, несущие активированный Ras-путь. Другим вирусом, разрушающим опухоли и специфически нацеленным на опухолевые клетки с активированным Ras-путем, является препарат на основе вируса простого герпеса II типа (HSV 2) под названием FusOn H2. Активирующие мутации белка Ras и вышестоящие элементы Ras-белка могут играть роль в более чем двух третях всех случаев рака у человека, включая большинство метастатических заболеваний. Reolysin, лекарственная форма реовируса, и FusOn H2 в настоящее время проходят клинические испытания или находятся в разработке для лечения различных видов рака. Кроме того, в клинических испытаниях для лечения местно-распространенного рака поджелудочной железы (NCT01188785, NCT01676259) находится лечение на основе siRNA, направленного против мутированного K RAS (G12D), под названием siG12D LODER. В моделях глиобластомы у мышей уровни SHP2 были повышены в раковых клетках мозга. Ингибирование SHP2, в свою очередь, ингибировало дефосфорилирование Ras. Это привело к уменьшению размеров опухоли и соответствующему увеличению показателей выживаемости. Другие стратегии были направлены на манипулирование регуляцией вышеупомянутой локализации Ras. Ингибиторы фарнезилтрансферазы были разработаны для прекращения фарнезилирования Ras и, следовательно, ослабления его сродства к мембранам. В научной литературе описана новая стратегия поиска ингибиторов для мутировавших молекул Ras. Мутации Ras в 12-м аминокислотном остатке ингибируют связывание регуляторной GAP-молекулы с мутировавшим Ras, вызывая неконтролируемый рост клеток. Новая стратегия предполагает поиск небольших молекул-«клея», которые присоединяют мутировавший Ras к GAP, предотвращая неконтролируемый рост клеток и восстанавливая нормальную функцию. Для этой цели была разработана теоретическая конформация Ras GAP с несколькими Å между молекулами, и проведен высокопроизводительный докинг in silico для поиска «клеящих» агентов. В качестве доказательства концепции были описаны две новые молекулы с удовлетворительной биологической активностью.

У других видов

В большинстве типов клеток большинства видов, большинство молекул Ras находятся в форме, связанной с GDP. Это справедливо для ооцитов Xenopus и фибробластов мыши.

Xenopus laevis (ореховый)

Как упоминалось выше, большинство Ras в яйцеклетках X. является GDP-конъюгатом. Ras млекопитающих почти наверняка индуцирует мейоз в яйцеклетках X. laevis, потенцируя инсулиноиндуцированный мейоз, но не прогестерон-индуцированный. Синтез белка, по-видимому, не участвует в этом этапе. Инъекция увеличивает синтез диацилглицерола из фосфатидилхолина. Некоторые эффекты мейоза антагонизируются rap1 (и Ras, модифицированным для некорректного докинга). И rap1, и модифицированный Ras являются ко-антагонистами p120Ras GAP в этом сигнальном пути.

Drosophila melanogaster (Дрозофила меланогастер)

Экспрессируется во всех тканях Drosophila melanogaster, но преимущественно в нервных клетках. Избыточная экспрессия оказывает несколько летальный эффект и в ходе развития приводит к аномалиям глаз и крыльев. (Это сопоставимо с и может объяснять подобные аномалии, вызванные мутациями в рецепторных тирозинкиназах.) Гены D., кодирующие rases у млекопитающих, вызывают аномалии развития.

Аплизия

Наибольшая экспрессия в видах Aplysia наблюдается в нервных клетках.

Caenorhabditis elegans (острый ракообразный)

Ген у C. elegans – let-60. Также, по-видимому, играет роль в формировании рецепторных тирозинкиназ в этой модели. Переэкспрессия вызывает развитие множественных вульв из-за его участия в нормальном развитии этой области; переэкспрессия в эффекторных сайтах приводит к летальному исходу.

Диктиостелий дискоидный

Необходим в Dictyostelium discoideum. Это подтверждается серьезными нарушениями развития при дефиците экспрессии ras и значительным ухудшением различных жизненных функций при его искусственном экспрессировании, включая: повышение концентрации инозитолфосфатов; вероятное снижение связывания cAMP с рецепторами хемотаксиса; и, вероятно, именно поэтому нарушается синтез cGMP. Активность аденилатциклазы на ras не реагирует.