Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Репрессор лактозы (LacI) — это белок, связывающий ДНК, который подавляет экспрессию генов, кодирующих белки, участвующие в метаболизме лактозы у бактерий. Эти гены репрессируются, когда лактоза недоступна клетке, обеспечивая тем самым, что бактерия тратит энергию на производство механизмов, необходимых для поглощения и утилизации лактозы, только при наличии лактозы. Когда лактоза становится доступной, она сначала превращается в аллолактозу β-галактозидазой (lacZ) в бактериях. Способность репрессора лактозы связываться с ДНК ингибируется вследствие аллостерической регуляции, что позволяет экспрессировать гены, кодирующие белки, участвующие в поглощении и утилизации лактозы.
DNA binding protein
The lac repressor (LacI) is a DNA binding protein that inhibits the expression of genes coding for proteins involved in the metabolism of lactose in bacteria. These genes are repressed when lactose is not available to the cell, ensuring that the bacterium only invests energy in the production of machinery necessary for uptake and utilization of lactose when lactose is present. When lactose becomes available, it is firstly converted into allolactose by β Galactosidase (lacZ) in bacteria. The DNA binding ability of lac repressor bound with allolactose is inhibited due to allosteric regulation, thereby genes coding for proteins involved in lactose uptake and utilization can be expressed.
Функция
Лаковый репрессор (LacI) функционирует посредством мотива "спираль-поворот-спираль" в своем ДНК-связывающем домене, специфически связываясь с основаниями в главной бороздке операторной области лакового оперона. Базовые контакты также формируются остатками симметричных альфа-спиралей, так называемых "шарнирных" спиралей, которые глубоко проникают во второстепенную бороздку. Связанный репрессор может снижать транскрипцию белков Lac, блокируя сайт связывания РНК-полимеразы или индуцируя петлеобразование ДНК. При присутствии лактозы аллолактоза связывается с лаковым репрессором, вызывая аллостерическое изменение его конформации. В измененном состоянии лаковый репрессор не способен прочно связываться со своим оператором. Таким образом, ген преимущественно выключен в отсутствие индуктора и преимущественно включен в его присутствии, хотя степень экспрессии гена зависит от количества репрессоров в клетке и от сродства связывания репрессора с ДНК. Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) является широко используемым аналогом аллолактозы, который может быть использован для индукции транскрипции генов, регулируемых лаковым репрессором.
The lac repressor (LacI) operates by a helix turn helix motif in its DNA binding domain, binding base specifically to the major groove of the operator region of the lac operon, with base contacts also made by residues of symmetry related alpha helices, the "hinge" helices, which bind deeply in the minor groove. This bound repressor can reduce transcription of the Lac proteins by occluding the RNA polymerase binding site or by prompting DNA looping. When lactose is present, allolactose binds to the lac repressor, causing an allosteric change in its shape. In its changed state, the lac repressor is unable to bind tightly to its cognate operator. Thus, the gene is mostly off in the absence of inducer and mostly on in the presence of inducer, although the degree of gene expression depends on the number of repressors in the cell and on the repressor's DNA binding affinity. Isopropyl β D 1 thiogalactopyranoside (IPTG) is a commonly used allolactose mimic which can be used to induce transcription of genes being regulated by lac repressor.
Кинетика связывания и развязывания ДНК
LacI находит ДНК-оператор цели удивительно быстро. In vitro поиск происходит в 10–100 раз быстрее, чем теоретический верхний предел для двух частиц, ищущих друг друга посредством диффузии в трех измерениях (3D). Для объяснения быстрого поиска было предложено, что LacI и другие факторы транскрипции (TF) находят свои сайты связывания посредством облегченной диффузии – комбинации свободной диффузии в 3D и 1D-скольжения по ДНК. Во время скольжения репрессор контактирует с ДНК-спиралью, скользя вокруг и отслеживая ее главную бороздку, что ускоряет процесс поиска, увеличивая эффективную длину цели при скольжении TF на оператор сбоку. Эксперименты in vivo с отдельными молекулами в клетках E. coli подтвердили модель облегченной диффузии, показав, что TF сканирует в среднем 45 п.н. во время каждого события скольжения, прежде чем спонтанно отсоединиться и возобновить исследование генома в 3D. Эксперименты in vivo и in vitro показали, что именно вероятность распознавания оператора изменяется в зависимости от последовательности ДНК, в то время как время, в течение которого TF остается в связанном состоянии на операторе, изменяется в меньшей степени. TF часто покидает последовательность, которую он должен регулировать, но на сильном целевом участке он почти всегда совершает очень короткое перемещение, прежде чем вернуться обратно. В макроскопическом масштабе это выглядит как стабильное взаимодействие. Этот механизм связывания объясняет, как белки, связывающиеся с ДНК, могут быстро искать в геноме клетки, не задерживаясь слишком долго на последовательностях, похожих на истинную цель. Моделирование молекулярной динамики всех атомов показывает, что фактор транскрипции сталкивается с энергетическим барьером в 1 kBT при скольжении и 12 kBT при диссоциации, что подразумевает, что репрессор в среднем скользит более чем на 8 п.н. перед диссоциацией. Модель поиска лакторепрессора in vivo включает межсегментный перенос и скачки, а также стерическое затруднение, создаваемое другими белками, что делает геном в клетках E. coli менее доступным для репрессора. Существование скачков, когда белок выскальзывает из главной бороздки ДНК, чтобы попасть в другую близлежащую бороздку вдоль цепи ДНК, было доказано более непосредственно in vitro, где лакторепрессор обходит операторы, меняет ориентацию и вращается с шагом, превышающим период ДНК в 10,5 п.н., при движении по ней.
LacI finds its target operator DNA surprisingly fast. In vitro the search is 10 100 times faster than the theoretical upper limit for two particles searching for each other via diffusion in three dimensions (3D). To explain the fast search, it was hypothesized that LacI and other transcription factors (TFs) find their binding sites by facilitated diffusion, a combination of free diffusion in 3D and 1D sliding on the DNA. During sliding the repressor is in contact with the DNA helix, sliding around and tracking its major groove, which speeds up the search process by extending the target length when the TF slides in onto the operator from the side. In vivo single molecule experiments with E. coli cells have now tested and verified the facilitated diffusion model, and shown that the TF scans on average 45 bp during each sliding event, before the TF detaches spontaneously and resumes exploring the genome in 3D. In vivo and in vitro experiments have shown that it is this probability to recognize the operator that changes with DNA sequence, while the time the TF remains in the bound conformation on the operator changes less with sequence. The TF often leaves the sequence it is intended to regulate, but at a strong target site, it almost always make a very short journey before finding the way back again. On the macroscopic scale, this looks like a stable interaction. This binding mechanism explains how DNA binding proteins manage to quickly search through the genome of the cell without getting stuck too long at sequences that resemble the true target. An all atom molecular dynamics simulation suggests that the transcription factor encounters a barrier of 1 kBT during sliding and 12 kBT for dissociation, implying that the repressor will slide over 8 bp on average before dissociating. The in vivo search model for the lac repressor includes intersegment transfer and hopping as well as crowding by other proteins which make the genome in E. coli cells less accessible for the repressor. The existence of hopping, where the protein slips out of the major groove of DNA to land in another nearby groove along the DNA chain, has been proven more directly in vitro, where the lac repressor has been observed to bypass operators, flip orientation, and rotate with a longer pitch than the 10.5 bp period of DNA while moving along it.
Открытие
Лакорепрессор был впервые выделен Уолтером Гилбертом и Бенно Мюллером Хиллом в 1966 году. Они показали, что in vitro белок связывается с ДНК, содержащей лакоперон, и высвобождает ДНК при добавлении IPTG (аналог аллолактозы).
The lac repressor was first isolated by Walter Gilbert and Benno Müller Hill in 1966. They showed that in vitro the protein bound to DNA containing the lac operon, and it released the DNA when IPTG (an analog of allolactose) was added.