Пикорнавирусы: структура, геном и особенности семейства

Введение

Семейство вирусов

Пикорнавирусы – это группа родственных неинкапсулированных РНК-вирусов, которые инфицируют позвоночных, включая рыб, млекопитающих и птиц. Они представляют собой большое семейство небольших, одноцепочечных РНК-вирусов положительной полярности с 30-нм икосаэдрической капсидой. Вирусы этого семейства могут вызывать широкий спектр заболеваний, включая обычную простуду, полиомиелит, менингит, гепатит и паралич. Пикорнавирусы составляют семейство Picornaviridae, порядок Picornavirales и домен Riboviria. В этом семействе насчитывается 158 видов, объединенных в 68 родов. Заметными примерами являются роды энтеровирусов (включая риновирусы и полиовирусы), афтовирусов, кардиовирусов и гепатовирусов.

Этимология

Название "пикорнавирус" имеет двойную этимологию. Во-первых, оно происходит от "пикорна", что является акронимом, образованным из названий "полиовирус, устойчивость к эфиру, вирус Коксаки, вирус-сирота, риновирус и рибонуклеиновая кислота". Во-вторых, название происходит от "пико", обозначающего чрезвычайно малую единицу измерения (равную 10−12), в сочетании с "РНК" для описания этой группы очень маленьких РНК-вирусов.

История

Первым обнаруженным вирусом животного происхождения (1897) был вирус ящура (FMDV). Он является прототипичным представителем рода Aphthovirus в семействе Picornaviridae. Полипротеиновый синтез, внутренние сайты инициации трансляции и некодируемая мРНК были впервые обнаружены при изучении клеток, инфицированных полиовирусом, а клон полиовируса стал первым инфекционным клоном ДНК, созданным на основе вируса РНК у животных. Вместе с риновирусом, полиовирус был первым животным вирусом, структура которого была определена методом рентгеновской кристаллографии. РНК-зависимая РНК-полимераза была обнаружена в менговирусе, роде пикорнавирусов.

Структура

Пикорнавирусы не имеют оболочки и обладают икосаэдрической капсидой. Геном не сегментирован и имеет положительный смысл (то есть такой же, как у мРНК млекопитающих, и считывается в направлении 5'–3'). В отличие от мРНК млекопитающих, пикорнавирусы не имеют 5'-кэпа, но содержат вирусный кодируемый белок, известный как VPg. Однако, как и мРНК млекопитающих, геном имеет поли(А)-хвост на 3'-конце. На обоих концах генома пикорнавируса находится нетранслируемая область (UTR). 5'-UTR обычно длиннее – около 500–1200 нуклеотидов (нт), по сравнению с 3'-UTR, которая составляет примерно 30–650 нт. Считается, что 5'-UTR играет важную роль в трансляции, а 3'-UTR – в синтезе отрицательной цепи РНК; однако 5'-конец также может влиять на вирулентность вируса. Остальная часть генома кодирует структурные белки в 5'-конце и неструктурные белки в 3'-конце в виде единого полипротеина. Полипротеин организован следующим образом: L 1ABCD 2ABC 3ABCD, где каждая буква обозначает белок, хотя существуют вариации этой организации. Белки 1A, 1B, 1C и 1D соответствуют капсидным белкам VP4, VP2, VP3 и VP1 соответственно. Расщепление полипротеина осуществляют вирусные протеазы, некоторые из которых действуют внутримолекулярно. Полипротеин первоначально расщепляется на P1, P2 и P3. P1 миристилируется на N-конце, после чего расщепляется на VP0, VP3 и VP1 – белки, формирующие прокапсиды; VP0 впоследствии расщепляется с образованием VP2 и VP4. Другие продукты расщепления включают 3B (VPg), 2C (АТФаза) и 3D (РНК-полимераза).

РНК-элементы

Геномные РНК пикорнавирусов содержат множество РНК-элементов, необходимых для синтеза как отрицательной, так и положительной цепей РНК. Для репликации требуется цис-действующий репликационный элемент (CRE). Структура шпильки-петли, содержащая CRE, не зависит от позиции, но изменяется в зависимости от типа вируса при идентификации. Кроме того, 3'-концевые элементы вирусной РНК значимы и эффективны для репликации РНК пикорнавирусов. 3'-конец пикорнавируса содержит поли(A)-тракт, который может быть необходим для инфекционности. Однако предполагается, что синтез РНК также происходит в этой области. 3'-концевая некодирующая область (NCR) полиовируса не требуется для синтеза отрицательной цепи, но является важным элементом для синтеза положительной цепи. Кроме того, 5'-концевая NCR, содержащая вторичные структурные элементы, необходима для репликации РНК и инициирования трансляции полиовируса. Внутренние сайты инициации трансляции рибосомы – это структуры РНК, позволяющие инициировать трансляцию независимо от кэпа и способные начинать трансляцию в середине мРНК.

Жизненный цикл

Вирусная частица связывается с рецепторами на поверхности клетки. Клеточные поверхностные рецепторы характеризуются для каждого серотипа пикорнавирусов. Например, рецептор полиовируса – гликопротеин CD155, являющийся специфическим рецептором для человека и некоторых других видов приматов. По этой причине полиовирус не удавалось культивировать во многих лабораториях до разработки в 1990-х годах трансгенных мышей, экспрессирующих рецептор CD155 на поверхности клеток. Эти животные могут быть инфицированы и использованы для изучения репликации и патогенеза. Попав внутрь клетки, РНК высвобождается, и геном (+) цепи РНК реплицируется через двухцепочечный РНК-промежуточный продукт, формирующийся с использованием вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы. Трансляция рибосомами клетки-хозяина не инициируется 5'-G-капкой, как обычно, а происходит посредством внутреннего участка инициации рибосомы. Жизненный цикл вируса протекает очень быстро, весь процесс репликации завершается в среднем в течение 8 часов. Однако уже через 30 минут после первоначальной инфекции синтез клеточных белков снижается почти до нуля – по сути, макромолекулярный синтез клеточных белков прекращается. В течение последующих 1–2 часов в ядре происходит потеря маргинации хроматина и однородности, после чего начинается синтез вирусных белков и в цитоплазме, вблизи ядра, появляется вакуоль, которая постепенно расширяется по мере увеличения времени после заражения до примерно 3 часов. После этого плазматическая мембрана клетки становится проницаемой; через 4–6 часов происходит сборка вирусных частиц, которые иногда можно увидеть в цитоплазме. Примерно через 8 часов клетка погибает и лизируется, высвобождая вирусные частицы. Экспериментальные данные, полученные в ходе экспериментов с кривыми однократного роста, позволили детально изучить репликацию пикорнавирусов. Вся репликация происходит в цитоплазме клетки-хозяина, и инфекция может происходить даже в клетках, не содержащих ядро (энуклеированных), и в клетках, обработанных актиномицином D (этот антибиотик ингибировал бы вирусную репликацию, если бы она происходила в ядре). Трансляция осуществляется посредством сдвига рамки считывания рибосомы, вирусной инициации и пропуска рибосомы. Вирус покидает клетку-хозяина путем лизиса и с помощью виропоринов. Позвоночные служат естественными хозяевами. Пути передачи включают фекально-оральный, контактный, пероральный и воздушно-капельный. Для инициации активности полимеразы, где праймер ковалентно связан с 5'-концом матричного РНК. Уридилирование происходит на остатке тирозина в третьей позиции VPg. CRE, представляющая собой структуру шпильки РНК, служит матрицей для уридилирования VPg, в результате чего синтезируется VPgpUpUOH. Мутации в структуре РНК CRE препятствуют уридилированию VPg, а мутации в последовательности VPg могут значительно снизить каталитическую активность RdRp. В то время как тирозиновый гидроксил VPg может инициировать синтез отрицательной цепи РНК независимо от CRE и VPgpUpUOH, синтез VPgpUpUOH, зависящий от CRE, абсолютно необходим для синтеза положительной цепи РНК. Уридилирование VPg, зависящее от CRE, снижает Km для UTP, необходимого для репликации вирусной РНК и синтеза VPgpUpUOH, зависящего от CRE, и требуется для эффективного синтеза отрицательной цепи РНК, особенно при низких концентрациях UTP. Праймер VPgpUpUOH переносится на 3'-конец матричного РНК для элонгации, которая может продолжаться путем добавления нуклеотидных оснований RdRp. Частичные кристаллические структуры VPg вируса ящура и вируса Коксаки B3 позволяют предположить, что на вирусной полимеразе могут быть два сайта для малых VPg пикорнавирусов. Структуры растворов НМР полиовирусного VPg и VPgpU показывают, что уридилирование стабилизирует структуру VPg, которая в противном случае достаточно гибкая в растворе. Второй сайт может быть использован для уридилирования, после чего VPgpU может инициировать синтез РНК. Праймеры VPg калицивирусов, структуры которых только начинают раскрываться, намного больше, чем у пикорнавирусов. Механизмы уридилирования и примирования могут быть существенно разными во всех этих группах. Уридилирование VPg может включать использование белков-предшественников, что позволяет определить возможный механизм локализации диуридилированного VPg, содержащего предшественник, на 3'-конце положительной или отрицательной цепи РНК для производства РНК полной длины. Детерминанты эффективности уридилирования VPg указывают на формирование и/или распад или высвобождение уридилированного продукта в качестве лимитирующей стадии in vitro в зависимости от используемого донора VPg. Белки-предшественники также влияют на специфичность и стабильность CRE VPg. Верхняя шпилька РНК, к которой связывается VPg, оказывает значительное влияние как на удержание, так и на рекрутирование VPg и Pol. Шпилька CRE частично раскручивается, позволяя компонентам-предшественникам связываться и рекрутировать VPg и Pol4. Петля CRE имеет определенную консенсусную последовательность, к которой связываются компоненты инициации, но консенсусной последовательности для поддерживающей шпильки не существует, что указывает на то, что важна только структурная стабильность CRE.

The viral particle binds to cell surface receptors. Cell surface receptors are characterized for each serotype of picornaviruses. For example, poliovirus receptor is glycoprotein CD155, which is special receptor for human and some other primate species. For this reason, poliovirus could not be made in many laboratories until transgenic mice having a CD155 receptor on their cell surfaces were developed in the 1990s. These animals can be infected and used for studies of replication and pathogenesis. Once inside the cell, the RNA uncoats and the (+) strand RNA genome is replicated through a double stranded RNA intermediate that is formed using viral RNA dependent RNA polymerase. Translation by host cell ribosomes is not initiated by a 5' G cap as usual, but rather is initiated by an internal ribosome entry site. The viral life cycle is very rapid, with the whole process of replication being completed on average within 8 hours. As little as 30 minutes after initial infection, though, cell protein synthesis declines to almost zero output – essentially the macromolecular synthesis of cell proteins is shut off. Over the next 1–2 hours, a loss of margination of chromatin and homogeneity occurs in the nucleus, before the viral proteins start to be synthesized and a vacuole appears in the cytoplasm close to the nucleus that gradually starts to spread as the time after infection reaches around 3 hours. After this time, the cell plasma membrane becomes permeable; at 4–6 hours, the virus particles assemble, and can sometimes be seen in the cytoplasm. Around 8 hours, the cell is effectively dead, and lyses to release the viral particles. Experimental data from single step growth curve like experiments have allowed observation of the replication of the picornaviruses in great detail. The whole of replication occurs within the host cell cytoplasm and infection can even happen in cells that do not contain a nucleus (enucleated) and those treated with actinomycin D (this antibiotic would inhibit viral replication if this occurred in the nucleus.) Translation takes place by 1 ribosomal frameshifting, viral initiation, and ribosomal skipping. The virus exits in host cell by lysis, and viroporins. Vertebrates serve as the natural hosts. Transmission routes are fecal oral, contact, ingestion, and air borne particles. to initiate polymerase activity, where the primer is covalently bound to the 5' end of the RNA template. The uridylylation occurs at a tyrosine residue at the third position of the VPg. A CRE, which is a RNA stem loop structure, serves as a template for the uridylylation of VPg, resulting in the synthesis of VPgpUpUOH. Mutations within the CRE RNA structure prevent VPg uridylylation, and mutations within the VPg sequence can severely diminish RdRp catalytic activity. While the tyrosine hydroxyl of VPg can prime negative strand RNA synthesis in a CRE and VPgpUpUOH independent manner, CRE dependent VPgpUpUOH synthesis is absolutely required for positive strand RNA synthesis. CRE dependent VPg uridylylation lowers the Km¬ of UTP required for viral RNA replication and CRE dependent VPgpUpUOH synthesis, and is required for efficient negative strand RNA synthesis, especially when UTP concentrations are limiting. The VPgpUpUOH primer is transferred to the 3’ end of the RNA template for elongation, which can continue by addition of nucleotide bases by RdRp. Partial crystal structures for VPgs of foot and mouth disease virus and coxsackie virus B3 suggest that there may be two sites on the viral polymerase for the small VPgs of the picornaviruses. NMR solution structures of poliovirus VPg and VPgpU show that uridylylation stabilizes the structure of the VPg, which is otherwise quite flexible in solution. The second site may be used for uridylylation,v after which the VPgpU can initiate RNA synthesis. The VPg primers of caliciviruses, whose structures are only beginning to be revealed, are much larger than those of the picornaviruses. Mechanisms for uridylylation and priming may be quite different in all of these groups. VPg uridylylation may include the use of precursor proteins, allowing for the determination of a possible mechanism for the location of the diuridylylated, VPg containing precursor at the 3' end of positive or negative strand RNA for production of full length RNA. Determinants of VPg uridylylation efficiency suggest formation and/or collapse or release of the uridylylated product as the rate limiting step in vitro depending upon the VPg donor employed. Precursor proteins also have an effect on VPg CRE specificity and stability. The upper RNA stem loop, to which VPg binds, has a significant impact on both retention, and recruitment, of VPg and Pol. The stem loop of CRE will partially unwind, allowing the precursor components to bind and recruit VPg and Pol4. The CRE loop has a defined consensus sequence to which the initiation components bind, but no consensus sequence exists for the supporting stem, which suggests that only the structural stability of the CRE is important.

Сборка и организация комплекса рибонуклеопротеина пикорнавируса VPg

Две молекулы 3CD (комплекс Vpg) связываются с CRE, причем домены 3C (домен Vpg) контактируют с верхним стеблем, а домены 3D (домен Vpg) – с нижним стеблем. Димер 3C раскрывает структуру РНК-стебля, формируя более стабильное взаимодействие с одноцепочечными участками, составляющими этот стебель. 3Dpol рекрутируется в этот комплекс и удерживается в нем благодаря физическому взаимодействию между задней частью субдомена "большой палец" 3Dpol и поверхностью одного или обоих субдоменов 3C комплекса 3CD. VPg также может играть важную роль в специфическом распознавании вирусного генома белками, обеспечивающими движение (MP), которые являются неструктурными белками, кодируемыми многими, если не всеми, растительными вирусами для обеспечения их перемещения из одной инфицированной клетки в соседние. MP и VPg взаимодействуют, обеспечивая специфичность транспорта вирусной РНК из клетки в клетку. Для обеспечения энергетических потребностей MP также взаимодействует с P10, представляющим собой клеточную АТФазу.

Болезни

Пикорнавирусы вызывают широкий спектр заболеваний. Энтеровирусы из семейства пикорнавирусов инфицируют желудочно-кишечный тракт, что и отражено в их названии. Риновирусы инфицируют преимущественно нос и горло. Энтеровирусы реплицируются при 37 °C, в то время как риновирусы лучше растут при 33 °C, поскольку это более низкая температура в носу. Энтеровирусы стабильны в кислых условиях, благодаря чему они способны выживать при контакте с желудочной кислотой. В отличие от них, риновирусы кислотно-лабильны (инактивируются или разрушаются в кислой среде), поэтому инфекции, вызванные риновирусами, ограничиваются носом и горлом.