Введение

Вакцина, содержащая ДНК

ДНК-вакцина – это тип вакцины, который трансфицирует специфическую антиген-кодирующую последовательность ДНК в клетки организма как механизм для индуцирования иммунного ответа. ДНК-вакцины работают путем инъекции генетически модифицированной плазмиды, содержащей последовательность ДНК, кодирующую антиген(ы), против которых требуется иммунный ответ, в результате чего клетки непосредственно производят антиген, вызывая тем самым защитную иммунологическую реакцию. ДНК-вакцины обладают теоретическими преимуществами перед традиционными вакцинами, включая «способность индуцировать более широкий спектр типов иммунного ответа». Несколько ДНК-вакцин были протестированы для ветеринарного применения. Альтернативно, ДНК может быть инкапсулирована в белок для облегчения проникновения в клетку. Если этот капсидный белок включен в ДНК, полученная вакцина может сочетать в себе эффективность живой вакцины без риска обратной мутации. В 1983 году Энцо Паолетти и Деннис Паникали из Департамента здравоохранения Нью-Йорка разработали стратегию производства рекомбинантных вакцин на основе ДНК, используя генную инженерию для преобразования обычной вакцины против оспы в вакцины, способные предотвращать другие заболевания. Они изменили ДНК вируса коровьей оспы, вставив ген из других вирусов (в частности, вируса простого герпеса, гепатита B и гриппа). В 1993 году Джеффри Ульмер и его коллеги из Исследовательских лабораторий Merck продемонстрировали, что прямая инъекция мышам плазмидной ДНК, кодирующей антиген гриппа, защитила животных от последующего экспериментального заражения вирусом гриппа. В 2016 году в Национальных институтах здоровья начались испытания ДНК-вакцины против вируса Зика на людях. Планировалось, что в исследовании примут участие до 120 человек в возрасте от 18 до 35 лет. Параллельно, Inovio Pharmaceuticals и GeneOne Life Science начали испытания другой ДНК-вакцины против Зики в Майами. Вакцина НИЗ вводится в верхнюю часть руки под высоким давлением. Производство вакцин в больших объемах оставалось нерешенной проблемой по состоянию на август 2016 года. Проводятся клинические испытания ДНК-вакцин для профилактики ВИЧ. В августе 2021 года индийские власти выдали разрешение на экстренное применение ZyCoV-D. Разработанная компанией Cadila Healthcare, это первая ДНК-вакцина против COVID-19.

Векторная конструкция

ДНК-вакцины вызывают наиболее выраженный иммунный ответ при использовании векторов с высокой экспрессией. Это плазмиды, которые обычно состоят из сильного вирусного промотора для обеспечения in vivo транскрипции и трансляции гена (или комплементарной ДНК) интересующего. Интрон А может быть добавлен для повышения стабильности мРНК и, следовательно, увеличения экспрессии белка. Плазмиды также содержат сильный полиадениляционный/транскрипционный сигнал терминации, например, последовательности полиадениляции гормона роста крупного рогатого скота или бета-глобулина кролика. Политицистронные векторы (с несколькими генами интереса) иногда создаются для экспрессии более одного иммуногена или для экспрессии иммуногена и иммуностимулирующего белка. Поскольку плазмиды, несущие относительно небольшой генетический код – до 200 Кб, являются "переносчиком", из которого экспрессируется иммуноген, оптимизация дизайна вектора для максимальной экспрессии белка является критически важной. Другим важным фактором является выбор промотора. Промотор SV40 традиционно использовался до тех пор, пока исследования не показали, что векторы, управляемые промотором вируса саркомы Роуса (RSV), демонстрируют значительно более высокие уровни экспрессии. Дополнительные модификации для повышения уровней экспрессии включают введение последовательностей энхансеров, синтетических интронов, последовательностей трипарлитного лидера аденовируса (TPL) и модификацию полиадениляционных и транскрипционных сигналов терминации. Вспомогательные участки, относящиеся к структуре плазмиды, могут быть вовлечены в широкий спектр явлений структурной нестабильности. Хорошо известные катализаторы генетической нестабильности включают прямые, инвертированные и тандемные повторы, которые часто встречаются во многих коммерчески доступных векторах для клонирования и экспрессии. Следовательно, уменьшение или полное устранение избыточных некодирующих последовательностей плазмидного "скелета" значительно снизит предрасположенность к таким событиям и, как следствие, общий рекомбиногенный потенциал плазмиды.

Механизм плазмид

Как только плазмида внедряется в ядро трансфицированной клетки, она кодирует пептидную цепочку чужеродного антигена. На своей поверхности клетка экспрессирует чужеродный антиген, связанный как с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса, так и II класса. Затем антигенпрезентирующая клетка перемещается в лимфатические узлы и представляет пептид антигена и костимуляторную молекулу Т-клеткам, инициируя иммунный ответ.

Конструкция вставки вакцины

Иммуногены могут быть направлены в различные клеточные компартменты для усиления антителоопосредованного или цитотоксического Т-клеточного ответа. Антигены, секретируемые или связанные с плазматической мембраной, более эффективно индуцируют антителоопосредованный ответ, чем цитозольные антигены, в то время как цитотоксический Т-клеточный ответ можно усилить, направляя антигены на цитоплазматическую деградацию с последующим представлением в комплексе главного гистосовместимости (MHC) класса I. Конформация белка также может влиять на антителоопосредованный ответ. "Упорядоченные" структуры (например, вирусные частицы) более эффективны, чем неупорядоченные структуры. Последовательности минигенов (или эпитопов MHC класса I) от разных патогенов вызывают цитотоксический Т-клеточный ответ к некоторым из них, особенно если включен и ТН-эпитоп. С тех пор было описано несколько других методов.

Инъекция солевого раствора

Инъекция в физиологическом растворе обычно проводится внутримышечно (IM) в скелетные мышцы или внутрикожно (ID), обеспечивая доставку ДНК во внеклеточные пространства. Это может быть усилено либо 1) электропорацией; 2) временным повреждением мышечных волокон миотоксинами, такими как бупивакаин; или 3) использованием гипертонических растворов физиологического раствора или сахарозы, а также слизистой оболочкой влагалища. Для перорального введения используются векторы Shigella или Listeria, направленные на слизистую оболочку кишечника, и рекомбинантные аденовирусные векторы.

Иммунизация ELI

Другой подход к ДНК-вакцинации — иммунизация библиотекой экспрессии (ELI). С помощью этой техники потенциально все гены патогена могут быть доставлены одновременно, что может быть полезно для патогенов, которые сложно ослабить или вырастить в культуре.

Дозировка

Способ доставки определяет дозу, необходимую для выработки эффективного иммунного ответа. Для инъекций солевого раствора требуется переменное количество ДНК, от 10 мкг до 1 мг, в то время как доставка с помощью генной пушки требует в 100–1000 раз меньшие дозы. Обычно требуется 0,2 мкг – 20 мкг, хотя сообщалось о случаях использования количеств, достигающих 16 нг. Каждый метод характеризуется уникальными паттернами экспрессии лимфокинов и хемокинов, специфическими типами иммуноглобулинов, особенностями миграции лимфоцитов и типами врожденных иммунных ответов.

Другие виды помощи Т-клеток

На тип Т-клеточной помощи влияют способ доставки и тип экспрессируемого иммуногена, а также нацеленность на различные лимфоидные компартменты. Как правило, инъекции солевым раствором (внутримышечные или внутрикожные) склонны индуцировать TH1-ответы, в то время как доставка с помощью генного пистолета вызывает TH2-ответы. Обычно тип Т-клеточной помощи, который формируется, стабилен во времени и не меняется при повторной стимуляции или последующих иммунизациях, которые в противном случае вызвали бы противоположный тип ответа у неиммунизированного организма. пДНК, введенная иглой, эндоцитируется дендритными клетками, которые затем стимулируются к дифференцировке для продукции TH1-цитокинов (IL-12), в то время как генный пистолет доставляет ДНК непосредственно в клетки, минуя TH1-стимуляцию.

Практическое применение поляризованных Т-клеток

Поляризация в помощи Т-клеткам полезна для модуляции аллергических реакций и аутоиммунных заболеваний. При аутоиммунных заболеваниях целью является смещение саморазрушающего TH1-ответа (с ассоциированной с ним цитотоксической активностью Т-клеток) в сторону неразрушающего TH2-ответа. Это успешно применяется для предварительной подготовки к формированию желаемого типа ответа в доклинических моделях.

Цитотоксические реакции Т-клеток

Одним из преимуществ ДНК-вакцин является то, что они способны индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) без присущего риска, связанного с живыми вакцинами. CTL-ответы могут быть вызваны против иммунодоминантных и иммунорецессивных CTL-эпитопов, а также субдоминантных CTL-эпитопов. Нацеливание генных продуктов непосредственно в ЭР (путем добавления сигнала вставки в ЭР к N-концу) должно, таким образом, усиливать CTL-ответы. Это было успешно продемонстрировано с использованием рекомбинантных вирусов вакцинии, экспрессирующих белки гриппа, или ГМ-ЦСФ для ДНК-вакцин против мышиной модели малярии P. yoelii. Совместное введение плазмид, кодирующих костимуляторные молекулы IL-12 и TCA3, показало увеличение CTL-активности против антигенов нуклеопротеина ВИЧ-1 и гриппа.

Гуморальный (антителовой) ответ

На реакцию антител, индуцированную ДНК-вакцинацией, влияют многочисленные факторы, включая тип антигена; локализацию антигена (то есть внутриклеточную или секреторную); количество, частоту и дозу введения; место и метод доставки антигена.

Кинетическая реакция антител

Гуморальные реакции после однократной инъекции ДНК могут сохраняться значительно дольше, чем после однократной инъекции рекомбинантного белка. Антитела к поверхностному антигену вируса гепатита B (HBsAg) поддерживаются до 74 недель без повторной стимуляции, в то время как у мышей после доставки с помощью генной пушки была продемонстрирована пожизненная защита от гемагглютинина гриппа. Антителосекретирующие клетки (АСК) мигрируют в костный мозг и селезенку для длительной продукции антител и, как правило, локализуются там через год. + Таблица 4. Сравнение Т-зависимых антительных ответов, вызванных иммунизацией ДНК, введением рекомбинантного белка и естественной инфекцией. Метод иммунизации ДНК-вакцина Рекомбинантный белок Естественная инфекция Количество индукционного антигена нг мкг ? (нг мкг) Продолжительность презентации антигена несколько недель < 1 недели несколько недель Кинетика антительного ответа медленный рост быстрый рост быстрый рост Количество введений для получения IgG с высокой авидностью и миграции АСК в костный мозг один два один Ab изотоп (на моделях мышей) C’ зависимый или C’ независимый C’ зависимый C’ независимый

При этом титры специфических антител, индуцированных вакцинацией ДНК, ниже, чем те, которые достигаются после вакцинации рекомбинантным белком. Однако антитела, индуцированные иммунизацией ДНК, демонстрируют более высокую аффинность к нативным эпитопам, чем антитела, индуцированные рекомбинантным белком. Иными словами, иммунизация ДНК индуцирует качественно превосходящий ответ. Антитела могут быть индуцированы после однократной вакцинации ДНК, в то время как вакцины на основе рекомбинантного белка обычно требуют повторной стимуляции. Иммунизация ДНК может быть использована для изменения TH-профиля иммунного ответа и, следовательно, изотопа антител, что невозможно при естественной инфекции или иммунизации рекомбинантным белком. Антитела, генерируемые с помощью ДНК, полезны в качестве подготовительного инструмента. Например, можно получить поликлональные и моноклональные антитела для использования в качестве реагентов.

Механизм поглощения ДНК

Когда впервые было продемонстрировано поглощение ДНК и последующая экспрессия в живом организме в мышечных клетках, эти клетки считались уникальными из-за их обширной сети Т-трубочек. С помощью электронной микроскопии было предположено, что поглощение ДНК облегчается кавеолами (или ямками, не покрытыми клатрином). Однако последующие исследования показали, что другие клетки (такие как кератиноциты, фибробласты и эпителиальные клетки Лангерганса) также способны интернализировать ДНК. Механизм поглощения ДНК остается неизвестным. Существует две доминирующие теории: поглощение ДНК в живом организме происходит неспецифически, посредством механизма, аналогичного фаго- или пиноцитозу. Эти механизмы могут включать в себя поверхностный рецептор размером 30 кДа, либо поверхностный рецептор размером 30 кДа, который специфически связывается с фрагментами ДНК длиной 4500 пар оснований (которые затем интернализируются) и обнаруживается на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и Т-клетках. Скэвенджер-рецепторы макрофагов связываются с различными макромолекулами, включая полирибонуклеотиды, и поэтому являются кандидатами на роль в поглощении ДНК. Рецептор-опосредованное поглощение ДНК может быть облегчено системами доставки с помощью генного пистолета, упаковкой в катионные липосомы и другими методами доставки, которые обходят этот путь проникновения. Однако понимание этого механизма может быть полезным для снижения затрат (например, за счет уменьшения потребности в цитофектинах), что может быть важно в животноводстве.

Представление антигена клетками, полученными из костного мозга

Исследования с использованием химерных мышей показали, что антиген представляется клетками, происходящими из костного мозга, включая дендритные клетки, макрофаги и специализированные B-клетки, называемые профессиональными клетками, представляющими антиген (APC). После инокуляции генопушкой на кожу, трансфицированные клетки Лангерганса мигрируют в дренирующий лимфатический узел для представления антигенов. Помимо прямой трансфекции дендритных клеток или макрофагов, происходит перекрестная презентация антигена после внутримышечного, внутрикожного введения и доставки ДНК генопушкой. Перекрестная презентация антигена происходит, когда клетка, происходящая из костного мозга, представляет пептиды белков, синтезированных в другой клетке, в контексте MHC класса I. Это может инициировать цитотоксический T-клеточный ответ и, по-видимому, имеет важное значение для полноценного первичного иммунного ответа.

Роль целевого сайта

Внутримышечное и внутрикожное введение ДНК инициируют иммунные ответы по-разному. В коже кератиноциты, фибробласты и клетки Лангерганса поглощают и экспрессируют антигены и отвечают за индукцию первичного антительного ответа. Трансфицированные клетки Лангерганса мигрируют из кожи (в течение 12 часов) в дренирующий лимфатический узел, где они активируют вторичные В- и Т-клеточные ответы. В скелетной мышце полосатые мышечные клетки чаще всего трансфицируются, но, по-видимому, не играют значимой роли в иммунном ответе. Вместо этого, ДНК, введенная внутримышечно, быстро поступает в дренирующий лимфатический узел, где трансфицируются дистальные дендритные клетки, которые затем инициируют иммунный ответ. Трансфицированные миоциты, по-видимому, служат "резервуаром" антигена для привлечения профессиональных антигенпрезентирующих клеток. Вакцинация ДНК может быть использована для подавления вирусных инфекций посредством неразрушительного контроля, опосредованного интерфероном. Это было продемонстрировано на примере гепатита B. Интерферон γ играет критически важную роль в контроле инфекций, вызываемых малярией, и является важным фактором при разработке противомалярийных ДНК-вакцин.

Иммуностимулирующие мотивы CpG

Сама ДНК плазмиды, по-видимому, оказывает адъювантное действие на иммунную систему. Это связано с распознаванием определенных иммуностимулирующих последовательностей динуклеотидов CpG. Стимулирующие CpG (CpG S) последовательности встречаются в двадцать раз чаще в ДНК бактериального происхождения, чем у эукариот. Это обусловлено тем, что у эукариот наблюдается «подавление CpG» – то есть пары динуклеотидов CpG встречаются гораздо реже, чем ожидалось. Кроме того, последовательности CpG S гипометилированы. Это часто встречается в бактериальной ДНК, в то время как CpG мотивы, встречающиеся у эукариот, метилируются в цитозиновом нуклеотиде. В противоположность этому, нуклеотидные последовательности, которые ингибируют активацию иммунного ответа (называемые нейтрализующими CpG, или CpG N), преобладают в геномах эукариот. Оптимальной иммуностимулирующей последовательностью является неметилированный динуклеотид CpG, фланкированный двумя 5'-пуринами и двумя 3'-пиримидинами. Стимулированные макрофаги секретируют IL-12, IL-18, TNF-α, IFN-α, IFN-β и IFN-γ, в то время как стимулированные B-клетки секретируют IL-6 и некоторое количество IL-12. Манипулирование последовательностями CpG S и CpG N в плазмидном основании ДНК-вакцин может обеспечить успешный иммунный ответ на закодированный антиген и направить иммунный ответ в сторону TH1-фенотипа. Это полезно, если для защиты от патогена требуется TH-ответ. Последовательности CpG S также использовались в качестве внешних адъювантов как для ДНК, так и для рекомбинантной белковой вакцинации с переменным успехом. Другие организмы с гипометилированными мотивами CpG продемонстрировали стимуляцию экспансии поликлональных B-клеток. Механизм этого может быть более сложным, чем простое метилирование – гипометилированная мышиная ДНК не вызывает иммунного ответа. Большинство данных об иммуностимулирующих последовательностях CpG получено в исследованиях на мышах. Экстраполяция этих данных на другие виды требует осторожности – отдельные виды могут требовать различных фланкирующих последовательностей, поскольку специфичность связывания скавенджер-рецепторов варьируется в зависимости от вида. Кроме того, такие виды, как жвачные, могут быть нечувствительны к иммуностимулирующим последовательностям из-за большой нагрузки на их желудочно-кишечный тракт.

Альтернативные ускорители

Иммунные ответы, индуцированные ДНК, могут быть усилены введением рекомбинантного белка или рекомбинантных оспенных вирусов. Стратегии "прайм-буст" с использованием рекомбинантного белка успешно повысили как титр нейтрализующих антител, так и авидность и устойчивость антител к слабым иммуногенам, таким как белок оболочки ВИЧ-1. Показано, что бустинг рекомбинантными вирусными векторами очень эффективен для усиления CTL-ответов, индуцированных ДНК. Прайминг с помощью ДНК фокусирует иммунный ответ на необходимом иммуногене, в то время как бустинг рекомбинантным вирусом обеспечивает большее количество экспрессируемого антигена, что приводит к значительному увеличению специфических CTL-ответов. Стратегии прайм-буст успешно применялись для индуцирования защиты от заражения малярией в ряде исследований. Мыши, прошедшие прайминг плазмидной ДНК, кодирующей поверхностный белок циркумспорозоита Plasmodium yoelii (PyCSP), а затем получившие бустинг рекомбинантным вакциновирусом, экспрессирующим тот же белок, демонстрировали значительно более высокие уровни антител, CTL-активности и IFN-γ, и, следовательно, более высокий уровень защиты, чем мыши, иммунизированные и усиленные только плазмидной ДНК. Это можно дополнительно улучшить, проведя прайминг смесью плазмид, кодирующих PyCSP и мышиный GM-CSF, перед бустингом рекомбинантным вакциновирусом. Обезьянам-резусам ввели многокомпонентную многоступенчатую ДНК-вакцину, кодирующую два антигена стадии развития в печени – поверхностный белок циркумспорозоита (PkCSP) и поверхностный белок спорозоита 2 (PkSSP2) – и два антигена стадии развития в крови – апикальный мерозоитный поверхностный белок 1 (PkAMA1) и мерозоитный поверхностный белок 1 (PkMSP1p42). Затем их бустировали рекомбинантным вирусом канарской оспы, кодирующим все четыре антигена (ALVAC 4). Иммунизированные обезьяны выработали антитела против спорозоитов и инфицированных эритроцитов, а также IFN-γ-секретирующие Т-клеточные ответы на пептиды PkCSP. Была достигнута частичная защита от заражения спорозоитами, а средняя паразитемия значительно снизилась по сравнению с контрольными обезьянами. Эти модели, хотя и не идеальны для экстраполяции на P. falciparum у человека, будут важны в ходе доклинических испытаний.

ДНК

Эффективность ДНК-иммунизации можно повысить, стабилизируя ДНК от деградации и увеличивая эффективность доставки ДНК в антигенпрезентирующие клетки. Это было продемонстрировано путем покрытия ДНК биоразлагаемыми катионными микрочастицами (такими как поли(лактид-ко-гликолид), сформулированными с использованием бромида цетилтриметиламмония). Такие микрочастицы, покрытые ДНК, могут быть столь же эффективны в индуцировании ЦТЛ, как и рекомбинантные вирусы, особенно при смешивании с адъювантом на основе алюминия. Микрочастицы диаметром 300 нм, по-видимому, наиболее эффективно поглощаются антигенпрезентирующими клетками.

Векторы альфавируса

Для повышения эффективности ДНК-вакцинации использовались рекомбинантные векторы на основе альфавирусов. Ген, кодирующий интересующий антиген, встраивается в репликон альфавируса, заменяя структурные гены, но сохраняя неструктурные гены репликазы. Для создания рекомбинантных репликонов альфавирусов использовались вирусы Синдбис и Семиликского леса. В отличие от традиционной ДНК-вакцинации, альфавирусные векторы приводят к гибели трансфицированных клеток и обеспечивают лишь временную экспрессию. Гены репликазы альфавируса экспрессируются наряду с вакциногенной вставкой. Механизм, посредством которого репликоны альфавирусов вызывают иммунный ответ, до конца не ясен, однако это может быть обусловлено высоким уровнем экспрессируемого белком, индуцированными репликоном цитокиновыми реакциями или индуцированным репликоном апоптозом, что приводит к усиленному захвату антигена дендритными клетками.