Образование сферопластов и их применение в исследованиях клеточной стенки бактерий и ионных каналов.
Spheroplast
Сферопласты: образование бактерий и дрожжей под действием антибиотиков (пенициллин, фосмидомицин). Изменение формы клеток при ингибировании синтеза пептидогликана.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
[[Файл:Пенициллиновые сферопласты.svg|thumb|upright|right|Грам-отрицательные бактерии, пытающиеся расти и делиться в присутствии антибиотиков, ингибирующих синтез пептидогликана (например, пенициллина), не способны это сделать и вместо этого формируют сферопласты. Согласно некоторым определениям, этот термин также распространяется на дрожжи. Название "сферопласт" происходит от того, что после разрушения клеточной стенки микроорганизма, напряжение мембраны заставляет клетку приобретать характерную сферическую форму. Антибиотики, ингибирующие биохимические пути, непосредственно предшествующие синтезу пептидогликана, также вызывают образование сферопластов (например, фосмидомицин, фосфоенолпируват). EDTA действует как агент, повышающий проницаемость, связывая двухвалентные ионы, такие как Ca2+, и удаляя их с внешней мембраны. Дрожжи Candida albicans могут быть преобразованы в сферопласты с использованием ферментов литиказы, хитиназы и β-глюкуронидазы.
[[File:Penicillin spheroplast generation. svg|thumb|upright|right|Gram negative bacteria attempting to grow and divide in the presence of peptidoglycan synthesis inhibiting antibiotics (e. g. penicillin) fail to do so, and instead end up forming spheroplasts. According to other definitions, the term also encompasses yeasts. The name spheroplast stems from the fact that after the microbe's cell wall is digested, membrane tension causes the cell to acquire a characteristic spherical shape. Antibiotics that inhibit biochemical pathways directly upstream of peptidoglycan synthesis induce spheroplasts too (e. g. fosmidomycin, phosphoenolpyruvate). EDTA acts as a permeabilizer by binding to divalent ions such as Ca2+ and removing them from the outer membrane. The yeast Candida albicans can be converted to spheroplasts using the enzymes lyticase, chitinase and β glucuronidase.
Открытие антибиотиков
С 1960-х по 1990-е годы компания Merck and Co. использовала скрининг на основе сферопластов в качестве основного метода для поиска антибиотиков, ингибирующих биосинтез клеточной стенки. В этом скрининге, разработанном Юджином Дулани, растущие бактерии подвергались воздействию тестируемых веществ в гипертонических условиях. Ингибиторы синтеза клеточной стенки вызывали образование сферопластов у растущих бактерий. Этот скрининг позволил обнаружить фосфомицин, цефамицин C, тиенамицин и несколько карбапенемов. Со временем клеточные стенки нитей подвергаются перевариванию, и бактерии превращаются в очень крупные сферы, окруженные только цитоплазматической и внешней мембранами. Затем мембраны можно анализировать с помощью патч-кламп аппарата для определения фенотипа ионных каналов, встроенных в них. Также распространена практика сверхэкспрессии конкретного канала для усиления его эффекта и облегчения его характеристики. Метод патч-клампинга гигантских сферопластов *E. coli* использовался для изучения нативных механочувствительных каналов (*MscL*, *MscS* и *MscM*) *E. coli*. Он был расширен для изучения других гетерологично экспрессируемых ионных каналов, и было показано, что гигантский сферопласт *E. coli* может использоваться как система экспрессии ионных каналов, сопоставимая с ооцитами *Xenopus*.
From the 1960s into the 1990s, Merck and Co. used a spheroplast screen as a primary method for discovery of antibiotics that inhibit cell wall biosynthesis. In this screen devised by Eugene Dulaney, growing bacteria were exposed to test substances under hypertonic conditions. Inhibitors of cell wall synthesis caused growing bacteria to form spheroplasts. This screen enabled the discovery of fosfomycin, cephamycin C, thienamycin and several carbapenems. After a period of time, the cell walls of the filaments are digested, and the bacteria collapse into very large spheres surrounded by just their cytoplasmic and outer membranes. The membranes can then be analyzed on a patch clamp apparatus to determine the phenotype of the ion channels embedded in it. It is also common to overexpress a particular channel to amplify its effect and make it easier to characterize. The technique of patch clamping giant E. coli spheroplasts has been used to study the native mechanosensitive channels (MscL, MscS, and MscM) of E. coli. It has been extended to study other heterologously expressed ion channels and it has been shown that the giant E. coli spheroplast can be used as an ion channel expression system comparable to the Xenopus oocyte.
Лизис клеток
Клетки дрожжей обычно защищены толстой клеточной стенкой, что затрудняет выделение клеточных белков. Ферментативное разрушение клеточной стенки зимолязой с образованием сферопластов делает клетки уязвимыми к легкому лизису с помощью детергентов или быстрым изменениям осмолярного давления. Эксперименты, проведенные по модифицированному протоколу Ханахана с использованием хлорида кальция в *E. coli*, показали, что сферопласты способны к трансформации с эффективностью 4,9x10−4.
Yeast cells are normally protected by a thick cell wall which makes extraction of cellular proteins difficult. Enzymatic digestion of the cell wall with zymolyase, creating spheroplasts, renders the cells vulnerable to easy lysis with detergents or rapid osmolar pressure changes. Upon conducting experiments following a modified Hanahan protocol using calcium chloride in E. coli, it was determined that spheroplasts may be able to transform at 4.9x10−4.