Пенициллин және сферапласттар: бактерия жасуша қабырғасының өзгеруі мен зерттелуі
Spheroplast
Пенициллин және антибиотиктер бактерия жасуша қабырғасын бұзып, сферапласттардың пайда болуына себеп болады. Бұл құбылыс бактериялар мен ашытқыларда кездеседі.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
[[Файл:Пенициллин сферапластын генерациялау.svg|thumb|upright|right|Пептидогликан синтезін тежейтін антибиотиктердің (мысалы, пенициллин) қатысуында грам-теріс бактериялар өсуге және бөлінуге тырысса, олар сәтті болмайды және оның орнына сферапласттар түзеді. Басқа анықтамаларға сәйкес, бұл терминге ашытқылар да кіреді. Сферапласт аталуы микробтың жасуша қабырғасы қорытылғаннан кейін мембрананың кернеуі жасушаның ерекше шар тәрізді пішінге ие болуына себеп болады. Пептидогликан синтезіне тікелей жоғары орналасқан биохимиялық жолдарды тежейтін антибиотиктер де сферапласттарды тудырады (мысалы, фосмидомицин, фосфоенолпируват). EDTA Ca2+ сияқты еківалентті иондарға байланысып, оларды сыртқы мембранадан шығару арқылы өткізгіштік қасиет көрсетеді. Candida albicans ашытқысын литиказа, хитиназа және β-глюкуронидаза ферменттерін қолдану арқылы сферапласттарға айналдыруға болады.
[[File:Penicillin spheroplast generation. svg|thumb|upright|right|Gram negative bacteria attempting to grow and divide in the presence of peptidoglycan synthesis inhibiting antibiotics (e. g. penicillin) fail to do so, and instead end up forming spheroplasts. According to other definitions, the term also encompasses yeasts. The name spheroplast stems from the fact that after the microbe's cell wall is digested, membrane tension causes the cell to acquire a characteristic spherical shape. Antibiotics that inhibit biochemical pathways directly upstream of peptidoglycan synthesis induce spheroplasts too (e. g. fosmidomycin, phosphoenolpyruvate). EDTA acts as a permeabilizer by binding to divalent ions such as Ca2+ and removing them from the outer membrane. The yeast Candida albicans can be converted to spheroplasts using the enzymes lyticase, chitinase and β glucuronidase.
Антибиотиктердің ашылуы
1960 жылдан 1990 жылдарға дейін Merck & Co. компаниясы клетка қабырғасының биосинтезін тежейтін антибиотиктерді табудың басты әдісі ретінде сферопласт экранын пайдаланды. Эуджин Дулани жасаған бұл экранда бактериялар гипертониялық жағдайда сынақ заттарының әсеріне ұшыратылды. Клетка қабырғасының синтезін тежеуші заттар бактериялардың өсу кезінде сферопласттар түзілуіне себеп болды. Бұл экран фосфомицин, цефамицин С, тиенамицин және бірнеше карбапенемдерді табуға мүмкіндік берді. Бір уақыттан кейін, жіп тәрізді бактериялардың клетка қабырғалары ыдырайды, және бактериялар тек цитоплазмалық және сыртқы мембраналарымен қоршалған өте үлкен шарларға айналады. Мембраналарды жапсырмалы тұтқалы аппаратта (patch clamp) талдап, ондағы иондық арналардың фенотипін анықтауға болады. Сонымен қатар, белгілі бір арнаның әсерін күшейту және оны сипаттауды жеңілдету үшін оны артық экспрессиялау да жиі қолданылады. Е. coli-ның ірі сферопластарын жамау әдісі (patch clamping) E. coli-ның табиғи механосезімтал арналарын (MscL, MscS және MscM) зерттеу үшін қолданылды. Бұл әдіс басқа гетерологты экспрессияланған иондық арналарды зерттеу үшін де пайдаланылды, сондай-ақ ірі E. coli сферопластары Xenopus ооцитіне баламалы иондық арна экспрессиясы жүйесі ретінде қолданылуы мүмкін екендігі көрсетілді.
From the 1960s into the 1990s, Merck and Co. used a spheroplast screen as a primary method for discovery of antibiotics that inhibit cell wall biosynthesis. In this screen devised by Eugene Dulaney, growing bacteria were exposed to test substances under hypertonic conditions. Inhibitors of cell wall synthesis caused growing bacteria to form spheroplasts. This screen enabled the discovery of fosfomycin, cephamycin C, thienamycin and several carbapenems. After a period of time, the cell walls of the filaments are digested, and the bacteria collapse into very large spheres surrounded by just their cytoplasmic and outer membranes. The membranes can then be analyzed on a patch clamp apparatus to determine the phenotype of the ion channels embedded in it. It is also common to overexpress a particular channel to amplify its effect and make it easier to characterize. The technique of patch clamping giant E. coli spheroplasts has been used to study the native mechanosensitive channels (MscL, MscS, and MscM) of E. coli. It has been extended to study other heterologously expressed ion channels and it has been shown that the giant E. coli spheroplast can be used as an ion channel expression system comparable to the Xenopus oocyte.
Жасуша лизисі
Ашытқы жасушалары әдетте қалың жасуша қабырғасымен қорғалған, бұл жасуша ішіндегі ақуыздарды бөліп алуды қиындатады. Цимолиза арқылы жасуша қабырғасын ферменттік түрде қорыту сферапласттарды құрады, бұл жасушаларды жуу құралдарымен (detergent-термен) оңай лизиске немесе осмолярлық қысымның күрт өзгеруіне осал етеді. E. coli бактериясында кальций хлоридін қолдана отырып, өзгертілген Ханахан протоколы бойынша жүргізілген эксперименттер нәтижесінде сферапласттардың 4.9x10−4 деңгейінде трансформацияға қабілетті екендігі анықталды.
Yeast cells are normally protected by a thick cell wall which makes extraction of cellular proteins difficult. Enzymatic digestion of the cell wall with zymolyase, creating spheroplasts, renders the cells vulnerable to easy lysis with detergents or rapid osmolar pressure changes. Upon conducting experiments following a modified Hanahan protocol using calcium chloride in E. coli, it was determined that spheroplasts may be able to transform at 4.9x10−4.