Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Семейство ферментов
Family of enzymes
ДНК-полимераза I (или Pol I) — это фермент, участвующий в процессе репликации прокариотической ДНК. Открытая Артуром Корнбергом в 1956 году, она была первой известной ДНК-полимеразой (и первой известной полимеразой вообще). Изначально была охарактеризована на E. coli и широко распространена у прокариот. У E. coli и многих других бактерий ген, кодирующий Pol I, известен как polA. Фермент E. coli Pol I состоит из 928 аминокислот и является примером процессивного фермента — он способен последовательно катализировать множество этапов полимеризации, не отсоединяясь от одноцепочечного шаблона. Основная физиологическая функция Pol I заключается в поддержании репарации поврежденной ДНК, но она также участвует в соединении фрагментов Оказаки, удаляя РНК-праймеры и заменяя рибонуклеотиды на ДНК.
DNA polymerase I (or Pol I) is an enzyme that participates in the process of prokaryotic DNA replication. Discovered by Arthur Kornberg in 1956, it was the first known DNA polymerase (and the first known of any kind of polymerase). It was initially characterized in E. coli and is ubiquitous in prokaryotes. In E. coli and many other bacteria, the gene that encodes Pol I is known as polA. The E. coli Pol I enzyme is composed of 928 amino acids, and is an example of a processive enzyme — it can sequentially catalyze multiple polymerisation steps without releasing the single stranded template. The physiological function of Pol I is mainly to support repair of damaged DNA, but it also contributes to connecting Okazaki fragments by deleting RNA primers and replacing the ribonucleotides with DNA.
Открытие
В 1956 году Артур Корнберг и его коллеги обнаружили Pol I, используя экстракты Escherichia coli (E. coli) для разработки анализа синтеза ДНК. Ученые добавили тимидин, меченный 14C, чтобы получить радиоактивный полимер ДНК, а не РНК. Для начала очистки ДНК-полимеразы исследователи добавили сульфат стрептомицина к экстракту E. coli. Это позволило разделить экстракт на супернатант, не содержащий нуклеиновых кислот (S-фракция), и осадок, содержащий нуклеиновые кислоты (P-фракция). P-фракция также содержала Pol I и термостабильные факторы, необходимые для реакций синтеза ДНК. Эти факторы были идентифицированы как нуклеозидтрифосфаты – строительные блоки нуклеиновых кислот. S-фракция содержала множество дезоксинуклеозидных киназ. В 1959 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена Артуру Корнбергу и Северо Очоа "за открытие механизмов, участвующих в биологическом синтезе рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот".
In 1956, Arthur Kornberg and colleagues discovered Pol I by using Escherichia coli (E. coli) extracts to develop a DNA synthesis assay. The scientists added 14C labeled thymidine so that a radioactive polymer of DNA, not RNA, could be retrieved. To initiate the purification of DNA polymerase, the researchers added streptomycin sulfate to the E. coli extract. This separated the extract into a nucleic acid free supernatant (S fraction) and nucleic acid containing precipitate (P fraction). The P fraction also contained Pol I and heat stable factors essential for the DNA synthesis reactions. These factors were identified as nucleoside triphosphates, the building blocks of nucleic acids. The S fraction contained multiple deoxynucleoside kinases. In 1959, the Nobel Prize in Physiology or Medicine was awarded to Arthur Kornberg and Severo Ochoa "for their discovery of the mechanisms involved in the biological synthesis of Ribonucleic acid and Deoxyribonucleic Acid."
Общая структура
Поли I главным образом функционирует в восстановлении поврежденной ДНК. По структуре Pol I является членом суперсемейства белков альфа/бета, которое включает белки, в которых α-спирали и β-листы встречаются в нерегулярных последовательностях. ДНК-полимераза I *E. coli* состоит из множества доменов с тремя различными ферментативными активностями. Три домена, часто называемые «большой палец», «палец» и «ладонь», работают совместно для поддержания активности ДНК-полимеразы. Четвертый домен, расположенный рядом с доменом «ладонь», содержит активный центр экзонуклеазы, который удаляет неправильно включенные нуклеотиды в направлении 3'–5' в процессе, известном как корректура. Пятый домен содержит другой активный центр экзонуклеазы, который удаляет ДНК или РНК в направлении 5'–3' и необходим для удаления РНК-праймера во время репликации ДНК или ДНК во время процессов восстановления ДНК. Бактерии *E. coli* производят 5 различных ДНК-полимераз: ДНК-полимераза I, ДНК-полимераза II, ДНК-полимераза III, ДНК-полимераза IV и ДНК-полимераза V. ДНК-полимеразы также не могут инициировать синтез цепей ДНК, поэтому им необходимы короткие РНК- или ДНК-фрагменты, известные как праймеры, для инициации. Рентгеноструктурный анализ полимеразных доменов ДНК-полимераз описывается аналогично правой руке человека. Все ДНК-полимеразы содержат три домена. Первый домен, известный как «домен пальца», взаимодействует с dNTP и комплементарной парой оснований матрицы. «Домен пальца» также взаимодействует с матрицей, чтобы правильно позиционировать ее в активном центре. Второй домен, известный как «домен ладони», катализирует реакцию переноса фосфорильной группы. Наконец, третий домен, известный как «домен большого пальца», взаимодействует с двухцепочечной ДНК. Домен экзонуклеазы содержит собственный каталитический центр и удаляет неправильно спаренные основания. Среди семи различных семейств ДНК-полимераз «домен ладони» консервативен в пяти из этих семейств. «Домен пальца» и «домен большого пальца» не являются консервативными в каждом семействе из-за различий в элементах вторичной структуры, обусловленных разными аминокислотными последовательностями. Чтобы определить, используется ли Pol I преимущественно для репликации ДНК или для восстановления повреждений ДНК, был проведен эксперимент с дефицитным мутантным штаммом *E. coli* Pol I. Мутантный штамм, лишенный Pol I, был изолирован и обработан мутагеном. Мутантный штамм сформировал колонии бактерий, которые продолжали нормально расти и также не содержали Pol I. Это подтвердило, что Pol I не требуется для репликации ДНК. Однако мутантный штамм также проявлял характеристики, включающие повышенную чувствительность к факторам, повреждающим ДНК, таким как ультрафиолетовое излучение. Таким образом, это подтвердило, что Pol I скорее участвует в восстановлении повреждений ДНК, чем в репликации ДНК.
Pol I mainly functions in the repair of damaged DNA. Structurally, Pol I is a member of the alpha/beta protein superfamily, which encompasses proteins in which α helices and β strands occur in irregular sequences. E. coli DNA Pol I consists of multiple domains with three distinct enzymatic activities. Three domains, often referred to as thumb, finger and palm domain work together to sustain DNA polymerase activity. A fourth domain next to the palm domain contains an exonuclease active site that removes incorrectly incorporated nucleotides in a 3' to 5' direction in a process known as proofreading. A fifth domain contains another exonuclease active site that removes DNA or RNA in a 5' to 3' direction and is essential for RNA primer removal during DNA replication or DNA during DNA repair processes. E. coli bacteria produces 5 different DNA polymerases: DNA Pol I, DNA Pol II, DNA Pol III, DNA Pol IV, and DNA Pol V. DNA polymerases also cannot initiate DNA chains so they must be initiated by short RNA or DNA segments known as primers. The X ray crystal structures of polymerase domains of DNA polymerases are described in analogy to human right hands. All DNA polymerases contain three domains. The first domain, which is known as the "fingers domain", interacts with the dNTP and the paired template base. The "fingers domain" also interacts with the template to position it correctly at the active site. Known as the "palm domain", the second domain catalyses the reaction of the transfer of the phosphoryl group. Lastly, the third domain, which is known as the "thumb domain", interacts with double stranded DNA. The exonuclease domain contains its own catalytic site and removes mispaired bases. Among the seven different DNA polymerase families, the "palm domain" is conserved in five of these families. The "finger domain" and "thumb domain" are not consistent in each family due to varying secondary structure elements from different sequences. In order to determine whether Pol I was primarily used for DNA replication or in the repair of DNA damage, an experiment was conducted with a deficient Pol I mutant strain of E. coli. The mutant strain that lacked Pol I was isolated and treated with a mutagen. The mutant strain developed bacterial colonies that continued to grow normally and that also lacked Pol I. This confirmed that Pol I was not required for DNA replication. However, the mutant strain also displayed characteristics which involved extreme sensitivity to certain factors that damaged DNA, like UV light. Thus, this reaffirmed that Pol I was more likely to be involved in repairing DNA damage rather than DNA replication.
Механизм
В процессе репликации RNase H удаляет РНК-праймер (созданный примазой) с отстающей цепи, а затем полимераза I заполняет необходимые нуклеотиды между фрагментами Оказаки (см. репликацию ДНК) в направлении 5'→3', осуществляя вычитку ошибок в процессе. Это фермент, зависимый от матрицы – он добавляет только те нуклеотиды, которые правильно комплементарны существующей цепи ДНК, служащей матрицей. Крайне важно, чтобы эти нуклеотиды имели правильную ориентацию и геометрию для образования пар оснований с ДНК-матрицей, чтобы ДНК-лигаза могла соединить различные фрагменты в непрерывную цепь ДНК. Исследования полимеразы I подтвердили, что различные dNTP могут связываться с одним и тем же активным центром полимеразы I. Полимераза I способна активно различать различные dNTP только после конформационных изменений. После этого Pol I проверяет правильную геометрию и выравнивание пары оснований, образованной между связанным dNTP и комплементарным основанием на матричной цепи. Только правильная геометрия пар оснований A=T и G≡C позволяет им поместиться в активный центр. Однако важно знать, что один из каждых 10⁴–10⁵ нуклеотидов добавляется некорректно. Тем не менее, Pol I может исправить эту ошибку в процессе репликации ДНК, используя свой селективный механизм активной дискриминации. Лаборант Кэрнса, Паула Де Лусия, создала тысячи клеточных экстрактов из колоний *E. coli* и проверила их на активность ДНК-полимеразы. 3478-й клон содержал мутант *polA*, названный Кэрнсом в честь "Паулы" [Де Лусия]. Только после открытия ДНК-полимеразы III была окончательно идентифицирована основная репликативная ДНК-полимераза.
In the replication process, RNase H removes the RNA primer (created by primase) from the lagging strand and then polymerase I fills in the necessary nucleotides between the Okazaki fragments (see DNA replication) in a 5'→3' direction, proofreading for mistakes as it goes. It is a template dependent enzyme—it only adds nucleotides that correctly base pair with an existing DNA strand acting as a template. It is crucial that these nucleotides are in the proper orientation and geometry to base pair with the DNA template strand so that DNA ligase can join the various fragments together into a continuous strand of DNA. Studies of polymerase I have confirmed that different dNTPs can bind to the same active site on polymerase I. Polymerase I is able to actively discriminate between the different dNTPs only after it undergoes a conformational change. Once this change has occurred, Pol I checks for proper geometry and proper alignment of the base pair, formed between bound dNTP and a matching base on the template strand. The correct geometry of A=T and G≡C base pairs are the only ones that can fit in the active site. However, it is important to know that one in every 104 to 105 nucleotides is added incorrectly. Nevertheless, Pol I can fix this error in DNA replication using its selective method of active discrimination. Cairns' lab assistant, Paula De Lucia, created thousands of cell free extracts from E. coli colonies and assayed them for DNA polymerase activity. The 3,478th clone contained the polA mutant, which was named by Cairns to credit "Paula" [De Lucia]. It was not until the discovery of DNA polymerase III that the main replicative DNA polymerase was finally identified.
Исследовательские приложения
ДНК-полимераза I, полученная из E. coli, широко используется в исследованиях в области молекулярной биологии. Однако, 5'→3' экзонуклеазная активность делает её непригодной для многих применений. Эту нежелательную ферментативную активность можно просто удалить из голофермента, чтобы получить полезную молекулу, называемую фрагментом Кленова, который широко используется в молекулярной биологии. Фактически, фрагмент Кленова использовался в первых протоколах амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР) до тех пор, пока в 1976 году не был обнаружен Thermus aquaticus – источник термостабильной Taq Polymerase I. Воздействие на ДНК-полимеразу I протеазы субтилизин расщепляет молекулу на более мелкий фрагмент, сохраняющий только ДНК-полимеразную и корректорскую активность.
DNA polymerase I obtained from E. coli is used extensively for molecular biology research. However, the 5'→3' exonuclease activity makes it unsuitable for many applications. This undesirable enzymatic activity can be simply removed from the holoenzyme to leave a useful molecule called the Klenow fragment, widely used in molecular biology. In fact, the Klenow fragment was used during the first protocols of polymerase chain reaction (PCR) amplification until Thermus aquaticus, the source of a heat tolerant Taq Polymerase I, was discovered in 1976. Exposure of DNA polymerase I to the protease subtilisin cleaves the molecule into a smaller fragment, which retains only the DNA polymerase and proofreading activities.