Механизмы инициации репликации ДНК и роль геликазы DnaB.
DnaB helicase
ДнаB геликаза: фермент для репликации ДНК у бактерий. Исследования структуры и механизма работы, димеризация N-терминального домена, взаимодействие с ДнаC и ДнаG.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Введение
DnaB-геликаза — фермент в бактериях, который раскрывает репликационную вилку во время репликации ДНК. Хотя механизм, посредством которого DnaB связывает гидролиз АТФ с транслокацией вдоль ДНК и денатурирует двухцепочечную структуру, остаётся неизвестным, наблюдалось изменение четвертичной структуры белка, включающее димеризацию N-концевого домена, которое, возможно, происходит в ходе ферментативного цикла. Изначально, при связывании DnaB с dnaA, он ассоциирован с dnaC, являющимся отрицательным регулятором. После диссоциации DnaC, DnaB связывается с dnaG. N-концевой домен имеет мультиспиральную структуру, формирующую ортогональный пучок.
DnaB helicase is an enzyme in bacteria which opens the replication fork during DNA replication. Although the mechanism by which DnaB both couples ATP hydrolysis to translocation along DNA and denatures the duplex is unknown, a change in the quaternary structure of the protein involving dimerisation of the N terminal domain has been observed and may occur during the enzymatic cycle. Initially when DnaB binds to dnaA, it is associated with dnaC, a negative regulator. After DnaC dissociates, DnaB binds dnaG. The N terminal has a multi helical structure that forms an orthogonal bundle.
Механизм инициирования репликации
В начальной фазе репликации участвуют по меньшей мере 10 различных ферментов или белков. Они раскручивают спираль ДНК в начале репликации и формируют предподготовительный комплекс для последующих реакций. Ключевым компонентом в процессе инициирования является белок DnaA, представитель семейства белков AAA+ АТФазы (АТФазы, связанные с разнообразной клеточной деятельностью). Многие AAA+ АТФазы, включая DnaA, формируют олигомеры и относительно медленно гидролизуют АТФ. Этот гидролиз АТФ действует как переключатель, опосредующий взаимопревращение белка между двумя состояниями. В случае DnaA, форма, связанная с АТФ, активна, а форма, связанная с АДФ, неактивна. Восемь молекул белка DnaA, все в форме, связанной с АТФ, собираются, образуя спиральный комплекс, охватывающий R и I сайты в oriC. DnaA имеет более высокое сродство к R-сайтам, чем к I-сайтам, и одинаково хорошо связывается с R-сайтами как в форме, связанной с АТФ, так и с АДФ. I-сайты, которые связывают только DnaA, связанный с АТФ, позволяют различать активные и неактивные формы DnaA. Плотно закрученная ДНК вокруг этого комплекса вводит эффективную положительную суперспираль. Возникающее напряжение в близлежащей ДНК приводит к денатурации в A:T-богатом регионе DUE (элемент раскручивания ДНК). Комплекс, формирующийся в начале репликации, также включает несколько белков, связывающих ДНК – Hu, IHF и FIS, которые облегчают изгиб ДНК. Затем белок DnaC, еще одна AAA+ АТФаза, загружает белок DnaB на разделенные нити ДНК в денатурированной области. Гексамер DnaC, каждая субъединица которого связана с АТФ, образует тесный комплекс с гексамерной кольцеобразной DnaB-геликазой. Взаимодействие DnaC и DnaB раскрывает кольцо DnaB, процессу способствует дальнейшее взаимодействие между DnaB и DnaA. Два кольцеобразных гексамера DnaB загружаются в DUE, по одному на каждую нить ДНК. Связанный с DnaC АТФ гидролизуется, высвобождая DnaC и оставляя DnaB, связанный с ДНК. Загрузка DnaB-геликазы является ключевым этапом инициирования репликации. Как репликативная геликаза, DnaB мигрирует вдоль одноцепочечной ДНК в направлении 5'→3', раскручивая ДНК по мере продвижения. Таким образом, DnaB-геликазы, загруженные на две нити ДНК, перемещаются в противоположных направлениях, создавая две потенциальные вилки репликации. Все остальные белки в вилке репликации связаны с DnaB напрямую или косвенно.
At least 10 different enzymes or proteins participate in the initiation phase of replication. They open the DNA helix at the origin and establish a prepriming complex for subsequent reactions. The crucial component in the initiation process is the DnaA protein, a member of the AAA+ ATPase protein family (ATPases associated with diverse cellular activities). Many AAA+ ATPases, including DnaA, form oligomers and hydrolyze ATP relatively slowly. This ATP hydrolysis acts as a switch mediating interconversion of the protein between two states. In the case of DnaA, the ATP bound form is active and the ADP bound form is inactive. Eight DnaA protein molecules, all in the ATP bound state, assemble to form a helical complex encompassing the R and I sites in oriC. DnaA has a higher affinity for the R sites than I sites, and binds R sites equally well in its ATP or ADP bound form. The I sites, which bind only the ATP bound DnaA, allow discrimination between the active and inactive forms of DnaA. The tight right handed wrapping of the DNA around this complex introduces an effective positive supercoil. The associated strain in the nearby DNA leads to denaturation in the A:T rich 'DUE' (DNA Unwinding Element) region. The complex formed at the replication origin also includes several DNA binding proteins Hu, IHF and FIS that facilitate DNA bending. The DnaC protein, another AAA+ ATPase, then loads the DnaB protein onto the separated DNA strands in the denatured region. A hexamer of DnaC, each subunit bound to ATP, forms a tight complex with the hexameric, ring shaped DnaB helicase. This DnaC DnaB interaction opens the DnaB ring, the process being aided by a further interaction between DnaB and DnaA. Two of the ring shaped DnaB hexamers are loaded in the DUE, one onto each DNA strand. The ATP bound to DnaC is hydrolyzed, releasing the DnaC and leaving the DnaB bound to the DNA. Loading of the DnaB helicase is the key step in replication initiation. As a replicative helicase, DnaB migrates along the single stranded DNA in the 5'→3' direction, unwinding the DNA as it travels. The DnaB helicases loaded onto the two DNA strands thus travel in opposite directions, creating two potential replication forks. All other proteins at the replication fork are linked directly or indirectly to DnaB.