Введение

Класс ферментов

Пируваткиназа – фермент, участвующий в последней стадии гликолиза. Она катализирует перенос фосфатной группы от фосфоенолпирувата (ФЕП) к аденозиндифосфату (АДФ), в результате чего образуется одна молекула пирувата и одна молекула АТФ. Пируваткиназа была ошибочно названа (несоответствуя общепринятому определению киназы) до того, как было установлено, что она не катализирует прямое фосфорилирование пирувата, которое не происходит в физиологических условиях. У животных пируваткиназа представлена четырьмя различными, тканеспецифичными изоферментами, каждый из которых обладает определенными кинетическими свойствами, необходимыми для адаптации к различным метаболическим потребностям разных тканей.

Изофермы у позвоночных

Четыре изофермента пируваткиназы, экспрессируемые у позвоночных: L (печень), R (эритроциты), M1 (мышцы и мозг) и M2 (ткани раннего развития плода и большинство тканей взрослых). Изоферменты L и R экспрессируются геном *PKLR*, в то время как изоферменты M1 и M2 экспрессируются геном *PKM2*. Изоферменты R и L отличаются от M1 и M2 тем, что подвергаются аллостерической регуляции. Кинетически, изоферменты R и L пируваткиназы имеют два различных конформационных состояния: одно с высокой аффинностью к субстрату и одно с низкой аффинностью к субстрату. R-состояние, характеризующееся высокой аффинностью к субстрату, является активированной формой пируваткиназы и стабилизируется PEP и фруктозо-1,6-бисфосфатом (FBP), стимулируя гликолитический путь. T-состояние, характеризующееся низкой аффинностью к субстрату, является инактивированной формой пируваткиназы, связанной и стабилизированной АТФ и аланином, что приводит к фосфорилированию пируваткиназы и ингибированию гликолиза. Изофермент M2 пируваткиназы может образовывать тетрамеры или димеры. Тетрамеры обладают высокой аффинностью к PEP, в то время как димеры – низкой аффинностью к PEP. Ферментативная активность может регулироваться путем фосфорилирования высокоактивных тетрамеров PKM2 в неактивные димеры. Ген *PKM* состоит из 12 экзонов и 11 интронов. PKM1 и PKM2 являются различными продуктами сплайсинга гена *PKM* (PKM1 содержит экзон 9, а PKM2 содержит экзон 10) и отличаются всего на 23 аминокислоты в пределах участка из 56 аминокислот (aa 378–434) на их карбоксильном конце. Ген *PKM* регулируется гетерогенными рибонуклеопротеинами, такими как hnRNPA1 и hnRNPA2. Мономер PKM2 человека состоит из 531 аминокислоты и представляет собой единую цепь, разделенную на домены A, B и C. Различие в аминокислотной последовательности между PKM1 и PKM2 позволяет PKM2 подвергаться аллостерической регуляции FBP и формировать димеры и тетрамеры, в то время как PKM1 может формировать только тетрамеры.

Изозимы в бактериях

Многие энтеробактерии, включая E. coli, имеют две изоформы пируваткиназы, PykA и PykF, которые на 37% идентичны в E. coli (Uniprot: PykA, PykF). Они катализируют ту же реакцию, что и у эукариотов, а именно образование АТФ из АДФ и ФЭФ, последнюю стадию гликолиза, стадию, которая необратима в физиологических условиях. PykF аллостерически регулируется FBP, что отражает центральную роль PykF в клеточном метаболизме. Транскрипция PykF в E. coli регулируется глобальным регулятором транскрипции Cra (FruR). Показано, что PfkB ингибируется MgATP при низких концентрациях фруктозо-6-фосфата, и эта регуляция важна для глюконеогенеза.

Гликолиз

В реакции пируваткиназы в гликолизе выделяют два этапа. Во-первых, ФЭП (фосфоенолпируват) передает фосфатную группу АДФ, образуя АТФ и энолят пирувата. Во-вторых, к эноляту пирувата необходимо добавить протон для получения функциональной формы пирувата, требуемой клетке. Поскольку субстратом для пируваткиназы является простой фосфосахар, а продуктом – АТФ, пируваткиназа может быть основополагающим ферментом для эволюции цикла гликолиза и, возможно, одним из древнейших ферментов во всей жизни на Земле. Фосфоенолпируват мог присутствовать в абиотических условиях и, как показано, образуется с высоким выходом в примитивном пути триозового гликолиза. В клетках дрожжей было обнаружено, что взаимодействие пируваткиназы дрожжей (YPK) с ФЭП и ее аллостерическим эффектором фруктозо-1,6-бисфосфатом (FBP) усиливается в присутствии Mg2+. Следовательно, было сделано заключение, что Mg2+ является важным кофактором в катализе превращения ФЭП в пируват пируваткиназой. Кроме того, было показано, что ион металла Mn2+ оказывает аналогичный, но более сильный эффект на YPK, чем Mg2+. Связывание ионов металлов с центрами связывания металлов в пируваткиназе увеличивает скорость этой реакции. Реакция, катализируемая пируваткиназой, является заключительным этапом гликолиза. Это один из трех лимитирующих стадий этого пути. Лимитирующие стадии – это более медленные, регулируемые стадии пути, которые, таким образом, определяют общую скорость пути. В гликолизе лимитирующие стадии связаны либо с гидролизом АТФ, либо с фосфорилированием АДФ, что делает путь энергетически выгодным и по существу необратимым в клетках. Этот заключительный этап строго регулируется и намеренно необратим, поскольку пируват является ключевым промежуточным звеном для дальнейших метаболических путей. После образования пируват либо поступает в цикл Кребса (ТЦА) для дальнейшего производства АТФ в аэробных условиях, либо превращается в молочную кислоту или этанол в анаэробных условиях.

Глюконеогенез: обратная реакция

Пируваткиназа также выполняет функцию регуляторного фермента глюконеогенеза – биохимического пути, в котором печень синтезирует глюкозу из пирувата и других субстратов. Глюконеогенез использует не углеводные источники для обеспечения глюкозой мозга и эритроцитов в условиях голодания, когда запасы глюкозы истощены. Тетрамеризация пируваткиназы стимулируется FBP и серином, а диссоциация тетрамера – L-цистеином.

Фруктоза-1,6-бисфосфат

FBP является наиболее значимым источником регуляции, поскольку образуется непосредственно в процессе гликолиза. FBP – это гликолитический промежуточный продукт, образующийся при фосфорилировании фруктозо-6-фосфата. FBP связывается с аллостерическим центром связывания в домене C пируваткиназы и изменяет конформацию фермента, что приводит к активации активности пируваткиназы. Будучи промежуточным продуктом, присутствующим в гликолитическом пути, FBP обеспечивает опережающую стимуляцию: чем выше концентрация FBP, тем сильнее аллостерическая активация и величина активности пируваткиназы. Пируваткиназа наиболее чувствительна к действию FBP. В результате остальные регуляторные механизмы играют второстепенную роль.

Ковалентные модификаторы

Ковалентные модификаторы служат косвенными регуляторами, контролируя фосфорилирование, дефосфорилирование, ацетилирование, сукцинилирование и окисление ферментов, что приводит к активации и ингибированию ферментативной активности. В печени глюкагон и эпинефрин активируют протеинкиназу А, которая выполняет функцию ковалентного модификатора, фосфорилируя и инактивируя пируваткиназу. В то же время, секреция инсулина в ответ на повышение уровня глюкозы в крови активирует фосфопротеинфосфатазу I, вызывая дефосфорилирование и активацию пируваткиназы для усиления гликолиза. Эта же ковалентная модификация оказывает противоположное действие на ферменты глюконеогенеза. Данная система регуляции предотвращает возникновение бесполезного цикла, не допуская одновременной активации пируваткиназы и ферментов, катализирующих глюконеогенез.

Гормональный контроль

Чтобы предотвратить бесплодный цикл, гликолиз и глюконеогенез подвергаются жесткой регуляции, чтобы гарантировать, что они никогда не функционируют одновременно в клетке. В результате ингибирование пируваткиназы глюкагоном, циклическим АМФ и адреналином не только подавляет гликолиз, но и стимулирует глюконеогенез. С другой стороны, инсулин противодействует эффекту глюкагона, циклического АМФ и адреналина, обеспечивая нормальную функцию пируваткиназы и подавление глюконеогенеза. Более того, было установлено, что глюкоза ингибирует и нарушает глюконеогенез, не оказывая влияния на активность пируваткиназы и гликолиз. В целом, взаимодействие гормонов играет ключевую роль в функционировании и регуляции гликолиза и глюконеогенеза в клетке.

Ингибирующее действие метформина

Метформин, или диметилбигуанид, является основным средством лечения сахарного диабета 2 типа. Показано, что метформин косвенно воздействует на пируваткиназу посредством ингибирования глюконеогенеза. В частности, добавление метформина связано со значительным снижением потока глюкозы и увеличением потока лактата/пирувата из различных метаболических путей. Хотя метформин не оказывает прямого влияния на активность пируваткиназы, он вызывает снижение концентрации АТФ. Вследствие аллостерического ингибирующего эффекта АТФ на пируваткиназу, снижение концентрации АТФ приводит к ослаблению ингибирования и последующей стимуляции пируваткиназы. Как следствие, увеличение активности пируваткиназы направляет метаболический поток по пути гликолиза, а не глюконеогенеза.

Регулирование генов

Гетерогенные рибонуклеотидные белки (hnRNP) могут воздействовать на ген PKM, регулируя экспрессию M1 и M2 изоформ. Изоформы PKM1 и PKM2 являются вариантами сплайсинга гена PKM, различающимися на один экзон. Различные типы hnRNP, такие как hnRNPA1 и hnRNPA2, проникают в ядро в условиях гипоксии и модулируют экспрессию, приводя к повышению регуляции PKM2. Гормоны, такие как инсулин, повышают экспрессию PKM2, в то время как гормоны, такие как трийодотиронин (T3) и глюкагон, способствуют снижению экспрессии PKM2.

Белки, связывающие углеводы с элементами реакции (ChREBP)

ChREBP — это фактор транскрипции, который регулирует экспрессию L-изофермента пируваткиназы. Модуль восприятия глюкозы содержит домены, являющиеся мишенями для регуляторного фосфорилирования в зависимости от концентраций глюкозы и цАМФ, что затем контролирует его импорт в ядро. Он также может быть дополнительно активирован прямым связыванием с глюкозо-6-фосфатом. Попав в ядро, его домены, связывающие ДНК, активируют транскрипцию пируваткиназы.

Мутация гена PK-LR

Дефицит пируваткиназы обусловлен аутосомно-рецессивным признаком. У млекопитающих имеется два гена пируваткиназы: PK LR (кодирующий изоферменты пируваткиназы L и R) и PK M (кодирующий изофермент пируваткиназы M1), однако только PKLR кодирует изофермент эритроцитов, который поражается при дефиците пируваткиназы. Идентифицировано более 250 мутаций гена PK LR, ассоциированных с дефицитом пируваткиназы. Исследование ДНК позволило установить локализацию гена PKLR на 1-й хромосоме и разработать методы прямого секвенирования генов для молекулярной диагностики дефицита пируваткиназы.

Ингибирование реактивных видов кислорода (РОС)

Реактивные виды кислорода (РОС) – это химически реактивные формы кислорода. В клетках легких человека было показано, что РОС ингибирует M2-изофермент пируваткиназы (PKM2). РОС осуществляет это ингибирование путем окисления Cys358 и инактивации PKM2. В результате инактивации PKM2 поток глюкозы больше не преобразуется в пируват, а вместо этого направляется в пентозофосфатный путь, что приводит к уменьшению и детоксикации РОС. Таким образом, вредное воздействие РОС усиливается, вызывая повышенный окислительный стресс в клетках легких и способствуя потенциальному образованию опухолей. Этот ингибирующий механизм имеет важное значение, поскольку он может указывать на то, что регуляторные механизмы в PKM2 способствуют устойчивости раковых клеток к окислительному стрессу и усилению опухолеобразования.

Ингибирование фенилаланина

Фенилаланин функционирует как конкурентный ингибитор пируваткиназы в мозге. Хотя степень ингибирующей активности фенилаланина сходна как в клетках плода, так и во взрослых клетках, ферменты в клетках мозга плода значительно более восприимчивы к ингибированию, чем ферменты в клетках мозга взрослых. Исследование PKM2 у младенцев с генетическим заболеванием мозга – фенилкетонурией (PKU) – показало повышенный уровень фенилаланина и сниженную эффективность PKM2. Этот механизм ингибирования позволяет лучше понять роль пируваткиназы в повреждении клеток мозга.

Пируваткиназа при раке

Раковые клетки характеризуются ускоренным метаболизмом, и считается, что пируваткиназа играет роль в развитии рака. По сравнению со здоровыми клетками, в раковых клетках наблюдается повышенный уровень изоформы PKM2, особенно низкоактивного димера. Поэтому уровни PKM2 в сыворотке используются в качестве маркеров рака. Низкоактивный димер способствует накоплению фосфоенолпирувата (PEP), обеспечивая высокие концентрации гликолитических промежуточных продуктов для синтеза биомолекул, необходимых раковым клеткам. Некоторые исследования указывают на сдвиг в экспрессии от PKM1 к PKM2 в процессе канцерогенеза. Микроокружение опухоли, такое как гипоксия, активирует факторы транскрипции, например, индуцируемый гипоксией фактор, для стимуляции транскрипции PKM2, что создает положительную обратную связь для усиления собственной транскрипции.