Метод построения калибровочной кривой для определения концентрации вещества
Calibration curve
Калибровочная кривая в аналитической химии: определение концентрации вещества в образце по сравнению со стандартами. Построение и применение кривых калибровки.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Метод определения концентрации вещества в неизвестном образце
Method for determining the concentration of a substance in an unknown sample
В аналитической химии калибровочная кривая, также известная как стандартная кривая, является общим методом определения концентрации вещества в неизвестном образце путем сравнения неизвестного образца с набором стандартных образцов с известной концентрацией. Калибровочная кривая – это один из подходов к задаче калибровки приборов; другие стандартные подходы могут включать добавление стандарта непосредственно в неизвестный образец, создавая внутренний стандарт. Калибровочная кривая представляет собой график зависимости показаний прибора, так называемого аналитического сигнала, от концентрации аналита (вещества, подлежащего измерению).
In analytical chemistry, a calibration curve, also known as a standard curve, is a general method for determining the concentration of a substance in an unknown sample by comparing the unknown to a set of standard samples of known concentration. A calibration curve is one approach to the problem of instrument calibration; other standard approaches may mix the standard into the unknown, giving an internal standard. The calibration curve is a plot of how the instrumental response, the so called analytical signal, changes with the concentration of the analyte (the substance to be measured).
Общее применение
В более общем смысле, калибровочная кривая — это график или таблица для измерительного прибора, который измеряет определенный параметр косвенно, предоставляя значения искомой величины в зависимости от показаний датчика. Например, для конкретного датчика давления можно построить калибровочную кривую, чтобы определить приложенное давление по выходному сигналу датчика (напряжению). Такая кривая обычно используется, когда прибор оснащен датчиком, калибровка которого различается от образца к образцу или меняется со временем или в процессе эксплуатации; если выходной сигнал датчика стабилен, прибор будет откалиброван непосредственно в единицах измерения искомой величины.
In more general use, a calibration curve is a curve or table for a measuring instrument which measures some parameter indirectly, giving values for the desired quantity as a function of values of sensor output. For example, a calibration curve can be made for a particular pressure transducer to determine applied pressure from transducer output (a voltage). Such a curve is typically used when an instrument uses a sensor whose calibration varies from one sample to another, or changes with time or use; if sensor output is consistent the instrument would be marked directly in terms of the measured unit.
Метод
Оператор готовит серию стандартов в диапазоне концентраций, близких к ожидаемой концентрации аналита в неизвестной пробе. Концентрации стандартов должны находиться в пределах рабочего диапазона используемого метода (инструмента). Анализ каждого из этих стандартов выбранным методом даст серию измерений. Для большинства анализов график зависимости показаний прибора от концентрации демонстрирует линейную зависимость. Оператор измеряет показания прибора для неизвестной пробы и, используя калибровочный график, может определить концентрацию аналита путем интерполяции. Данные – концентрации аналита и показания прибора для каждого стандарта – могут быть аппроксимированы прямой линией с помощью линейного регрессионного анализа. Это дает модель, описываемую уравнением y = mx + y0, где y – показания прибора, m – чувствительность, а y0 – константа, характеризующая фоновый сигнал. Концентрацию аналита (x) в неизвестных пробах можно рассчитать по этому уравнению. В качестве аналитического сигнала могут использоваться различные параметры. Например, хром (III) можно определять методом хемолюминесценции в приборе, оснащенном фотоэлектронным умножителем (ФЭУ) в качестве детектора. Детектор преобразует свет, испускаемый пробой, в напряжение, которое возрастает с увеличением интенсивности света. Интенсивность измеренного света является аналитическим сигналом.
The operator prepares a series of standards across a range of concentrations near the expected concentration of analyte in the unknown. The concentrations of the standards must lie within the working range of the technique (instrumentation) they are using. Analyzing each of these standards using the chosen technique will produce a series of measurements. For most analyses a plot of instrument response vs. concentration will show a linear relationship. The operator can measure the response of the unknown and, using the calibration curve, can interpolate to find the concentration of analyte. The data the concentrations of the analyte and the instrument response for each standard can be fit to a straight line, using linear regression analysis. This yields a model described by the equation y = mx + y0, where y is the instrument response, m represents the sensitivity, and y0 is a constant that describes the background. The analyte concentration (x) of unknown samples may be calculated from this equation. Many different variables can be used as the analytical signal. For instance, chromium (III) might be measured using a chemiluminescence method, in an instrument that contains a photomultiplier tube (PMT) as the detector. The detector converts the light produced by the sample into a voltage, which increases with intensity of light. The amount of light measured is the analytical signal.
Пример
Брэдфордский анализ — это колориметрический метод определения концентрации белка. Реагент Coomassie brilliant blue окрашивается в синий цвет при связывании с аргинином и ароматическими аминокислотами, содержащимися в белках, что приводит к увеличению поглощения образца. Поглощение измеряется с помощью спектрофотометра на длине волны максимального поглощения (Amax) синего красителя, которая составляет 595 нм. В этом случае, чем выше поглощение, тем выше концентрация белка. Для построения стандартной кривой используются данные о поглощении для известных концентраций белка, где концентрация откладывается по оси X, а значение поглощения – по оси Y. Затем тот же анализ проводится с образцами неизвестной концентрации. Для анализа данных находят на оси Y значение поглощения, соответствующее измерению неизвестного вещества, и проводят линию до пересечения со стандартной кривой. Значение по оси X в точке пересечения соответствует концентрации вещества в неизвестном образце.
The Bradford assay is a colorimetric assay that measures protein concentration. The reagent Coomassie brilliant blue turns blue when it binds to arginine and aromatic amino acids present in proteins, thus increasing the absorbance of the sample. The absorbance is measured using a spectrophotometer, at the maximum absorbance frequency (Amax) of the blue dye (which is 595 nm). In this case, the greater the absorbance, the higher the protein concentration. Data for known concentrations of protein are used to make the standard curve, plotting concentration on the X axis, and the assay measurement on the Y axis. The same assay is then performed with samples of unknown concentration. To analyze the data, one locates the measurement on the Y axis that corresponds to the assay measurement of the unknown substance and follows a line to intersect the standard curve. The corresponding value on the X axis is the concentration of substance in the unknown sample.
Преимущества и недостатки
Большинство аналитических методов используют калибровочную кривую. Такой подход имеет ряд преимуществ. Во-первых, калибровочная кривая обеспечивает надежный способ расчета неопределенности концентрации, вычисленной по калибровочной кривой (с использованием статистики наименьших квадратов при аппроксимации данных). Во-вторых, калибровочная кривая предоставляет данные об эмпирической зависимости. Механизм отклика прибора на аналит может быть предсказан или понят на основе некоторой теоретической модели, но большинство таких моделей имеют ограниченную применимость к реальным образцам. (Отклик прибора обычно сильно зависит от состояния аналита, используемых растворителей и содержащихся в нем примесей; на него также могут влиять внешние факторы, такие как давление и температура.) Многие теоретические зависимости, например, флуоресценция, в любом случае требуют определения инструментальной константы путем анализа одного или нескольких референсных стандартов; калибровочная кривая является удобным расширением этого подхода. Калибровочная кривая для конкретного аналита в конкретном (типе) образца обеспечивает необходимую эмпирическую зависимость для этих конкретных измерений. Основными недостатками являются (1) необходимость наличия запаса анализируемого вещества для приготовления стандартов, предпочтительно высокой чистоты и с известной концентрацией, и (2) требование, чтобы стандарты и образец находились в одной матрице. Некоторые аналиты, например, отдельные белки, чрезвычайно трудно получить в чистом виде в достаточном количестве. Другие аналиты часто встречаются в сложных матрицах, например, тяжелые металлы в прудовой воде. В этом случае матрица может мешать или ослаблять сигнал аналита. Поэтому сравнение между стандартами (которые не содержат мешающих соединений) и образцом невозможно. Метод стандартных добавок позволяет решить эту проблему.
Most analytical techniques use a calibration curve. There are a number of advantages to this approach. First, the calibration curve provides a reliable way to calculate the uncertainty of the concentration calculated from the calibration curve (using the statistics of the least squares line fit to the data). Second, the calibration curve provides data on an empirical relationship. The mechanism for the instrument's response to the analyte may be predicted or understood according to some theoretical model, but most such models have limited value for real samples. (Instrumental response is usually highly dependent on the condition of the analyte, solvents used and impurities it may contain; it could also be affected by external factors such as pressure and temperature.) Many theoretical relationships, such as fluorescence, require the determination of an instrumental constant anyway, by analysis of one or more reference standards; a calibration curve is a convenient extension of this approach. The calibration curve for a particular analyte in a particular (type of) sample provides the empirical relationship needed for those particular measurements. The chief disadvantages are (1) that the standards require a supply of the analyte material, preferably of high purity and in known concentration, and (2) that the standards and the unknown are in the same matrix. Some analytes e. g., particular proteins are extremely difficult to obtain pure in sufficient quantity. Other analytes are often in complex matrices, e. g., heavy metals in pond water. In this case, the matrix may interfere with or attenuate the signal of the analyte. Therefore, a comparison between the standards (which contain no interfering compounds) and the unknown is not possible. The method of standard addition is a way to handle such a situation.