Гаптены: малые молекулы, вызывающие иммунный ответ в комплексе с белками-носителями.

Введение

Молекула, запускающая иммунный ответ при связывании с носителем.

Гаптены (от греческого haptein, означающего «скреплять») – это небольшие молекулы, которые вызывают иммунный ответ только при соединении с крупным носителем, таким как белок; этот носитель сам по себе может не вызывать иммунного ответа. Механизмы отсутствия иммунного ответа могут быть разнообразными и включать сложные иммунологические взаимодействия, но могут заключаться в отсутствии или недостаточности костимулирующих сигналов от антигенпрезентирующих клеток. Гаптены использовались для изучения аллергического контактного дерматита (АКД) и механизмов воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) для индуцирования аутоиммуноподобных реакций. Концепция гаптенов возникла в работах австрийского иммунолога Карла Ландштейнера, который также был пионером в использовании синтетических гаптенов для изучения иммунохимических явлений.

Иммунная реакция на гаптенно-носитель аддукта

Применение гаптенов на коже, при конъюгации с носителем, может вызывать контактную гиперчувствительность, представляющую собой реакцию гиперчувствительности IV типа с отсроченным началом, опосредованную Т-клетками и дендритными клетками. Она состоит из двух фаз: сенсибилизации и элицитации. Фаза сенсибилизации, когда гаптен наносится на кожу впервые, характеризуется активацией врожденного иммунного ответа, включая миграцию дендритных клеток в лимфатические узлы, активацию антиген-специфических наивных Т-клеток и генерацию антиген-специфических эффекторных или Т-клеток памяти, а также В-клеток и плазматических клеток, секретирующих антитела. Вторая фаза элицитации, когда гаптен наносится на другой участок кожи, начинается с активации эффекторных Т-клеток, за которой следует повреждение тканей, опосредованное Т-клетками, и иммунные реакции, опосредованные антителами. Гаптены первоначально активируют врожденный иммунный ответ посредством сложных механизмов, включающих воспалительные цитокины, молекулярные паттерны, связанные с повреждением (DAMP), или инфламмасому. После того, как организм выработал антитела к аддукту гаптена с носителем, малая молекула гаптена также может связываться с антителом, но обычно не инициирует иммунный ответ; как правило, это может сделать только аддукт гаптена с носителем. Иногда малая молекула гаптена может даже блокировать иммунный ответ на аддукт гаптена с носителем, предотвращая связывание аддукта с антителом, что называется гаптен-ингибированием. Хорошо известным примером гаптена является урушиол, который является токсином, содержащимся в ядовитом плюще. При абсорбции через кожу из растения ядовитого плюща урушиол подвергается окислению в клетках кожи с образованием фактического гаптена – реактивной молекулы типа хинона, которая затем реагирует с белками кожи, образуя гаптен-аддукты. После повторного воздействия пролиферировавшие Т-клетки активируются, вызывая иммунную реакцию, которая приводит к образованию типичных волдырей при контактном дерматите, вызванном урушиолом. Другим примером контактного дерматита, опосредованного гаптеном, является аллергия на никель, вызванная проникновением ионов никеля в кожу и их связыванием с белками кожи.

Haptens applied on skin, when conjugate with a carrier, could induce contact hypersensitivity, which is a type IV delayed hypersensitivity reaction mediated by T cells and dendritic cells. It consists of two phases: sensitization and elicitation. The sensitization phase where the hapten is applied to the skin for the first time is characterized by the activation of innate immune responses, including migration of dendritic cells to the lymph nodes, priming antigen specific naive T cells, and the generation of antigen specific effector or memory T cells and B cells and antibody secreting plasma cells. The second elicitation phase where the hapten is applied to a different skin area starts with activation of effector T cells followed by T cell mediated tissue damage and antibody mediated immune responses. Haptens initially activate innate immune responses by complex mechanisms involving inflammatory cytokines, damage associated molecular patterns (DAMP), or the inflammasome. Once the body has generated antibodies to a hapten carrier adduct, the small molecule hapten may also be able to bind to the antibody, but it will usually not initiate an immune response; usually only the hapten carrier adduct can do this. Sometimes the small molecule hapten can even block immune response to the hapten carrier adduct by preventing the adduct from binding to the antibody, a process called hapten inhibition. A well known example of a hapten is urushiol, which is the toxin found in poison ivy. When absorbed through the skin from a poison ivy plant, urushiol undergoes oxidation in the skin cells to generate the actual hapten, a reactive quinone type molecule, which then reacts with skin proteins to form hapten adducts. After a second exposure, the proliferated T cells become activated, generating an immune reaction that produces typical blisters of a urushiol induced contact dermatitis. Other example of a hapten mediated contact dermatitis is nickel allergy, which is caused by nickel metal ions penetrating the skin and binding to skin proteins.

Примеры гаптенов

Много гаптенов содержится в различных видах лекарств, пестицидов, гормонов, пищевых токсинов и т.д. Наиболее важным фактором является молекулярная масса, которая менее 1000 Да. Первыми исследованными гаптенами были анилин и его карбоксильные производные (орто-, мета- и пара-аминобензойная кислота). Некоторые гаптены могут вызывать аутоиммунные заболевания. Примером является гидралазин, препарат, снижающий кровяное давление, который иногда может вызывать лекарственно-индуцированный системный красный волчанок у некоторых людей. По-видимому, этот же механизм лежит в основе того, как анестезирующий газ галотан может вызвать опасный для жизни гепатит, а также как препараты класса пенициллинов вызывают аутоиммунную гемолитическую анемию. Другие гаптены, часто используемые в молекулярной биологии, включают флуоресцеин, биотин, дигоксигенин и динитрофенол. Антитела успешно получали против эндогенных и нереакционноспособных малых молекул, таких как некоторые нейротрансмиттеры (например, серотонин (5-HT), глутамат, дофамин, ГАМК, триптамин, глицин, норадреналин), аминокислоты (например, триптофан, 5-гидрокситриптофан, 5-метокситриптофан), используя глутаровый альдегид для сшивания этих молекул с белками-носителями, подходящими для иммунного распознавания. Важно отметить, что для обнаружения таких малых молекул в тканях требуется фиксация ткани глутаровым альдегидом, поскольку ковалентная связь глутарового альдегида с молекулой, представляющей интерес, часто является частью эпитопа, распознаваемого антителом.

Хаптенская конъюгация

Из-за своей природы и свойств, аддукты гаптена с носителем сыграли важную роль в иммунологии. Они использовались для оценки характеристик специфических эпитопов и антител. Они необходимы для очистки и производства моноклональных антител. Они также имеют решающее значение для разработки высокочувствительных количественных и качественных иммуноанализов.

Перевозчики

В общем, белки-носители должны быть иммуногенными и содержать достаточное количество аминокислотных остатков в реактивных боковых цепях для конъюгации с гаптенами. Для протеиновой гаптенации гаптен должен быть электронно-дефицитным (электрофильным), либо сам по себе, либо он может быть преобразован в протеинореактивные соединения, например, путем окисления на воздухе или метаболизма в коже. Гаптены присоединяются к молекуле-носителю посредством ковалентной связи. В зависимости от используемых гаптенов, при выборе белка-носителя следует учитывать и другие факторы, такие как in vivo токсичность, коммерческая доступность и стоимость. Перекрестное сшивание с использованием промежуточных молекул: Этот метод в основном применяется к нереактивным гаптенам. Для содействия конъюгации гаптенов с их носителями используются агенты, содержащие по крайней мере две химически реактивные группы, такие как карбодимид или глутаральдегид. Степень перекрестного сшивания зависит от соотношения гаптен/носитель к сшивающему агенту, концентрации гаптен/носитель, температуры и pH среды. Глутаральдегид: Этот метод основан на реакции глутаральдегида с аминогруппами с образованием оснований Шиффа или продуктов присоединения по Михаэлю (двойная связь). Выход конъюгатов можно контролировать, изменяя pH реакции. Более высокий pH приводит к образованию большего количества промежуточных оснований Шиффа и, следовательно, к увеличению числа и размера гаптенных конъюгатов. В целом, перекрестное сшивание с использованием глутаральдегида очень стабильно. Однако иммунизированные животные склонны распознавать перекрестные сшивки глутаральдегида как эпитопы. Высокоэффективный капиллярный электрофорез: Высокоэффективный капиллярный электрофорез (ВЭКЭ) является альтернативным методом оптимизации конъюгации гаптен-белка. ВЭКЭ преимущественно используется для разделения углеводов с очень высокой разрешающей способностью. Использование ВЭКЭ в качестве метода исследования определенных конъюгатов имеет многочисленные преимущества, такие как необходимость лишь в минимальных объемах образца (нл). Кроме того, используемый образец не обязательно должен быть чистым и не требуется радиоактивная маркировка. Значительным преимуществом этого метода гаптенной конъюгации является автоматизированный анализ образца и возможность определения взаимодействия образцов в свободном растворе. Этот метод гаптенной конъюгации особенно эффективен для конъюгатов с низкой плотностью эпитопов, где определение их электрической или ионной подвижности другими методами затруднено.

In general, carrier proteins should be immunogenic and contain enough amino acid residues in the reactive side chains to conjugate with the haptens. For protein haptenation to occur, hapten must be electron deficient (electrophilic), either by itself, or it can be converted to a protein reactive species for example by air oxidation or cutaneous metabolism. Haptens become fastened to a carrier molecule by a covalent bond. Depending on the haptens being used, other factors in considering the carrier proteins could include their in vivo toxicity, commercial availability and cost. Intermediary molecules cross linkage: This method mainly applies to nonreactive haptens. Agents with at least two chemically reactive groups such as carbodiimide or glutaraldehyde are to aid the conjugation of haptens to their carriers. The extent of cross linkage is dependent upon the hapten/carrier to coupling agent ratio, hapten/carrier concentration and the temperature, pH of the environment. Glutaraldehyde: This method works by the reaction between glutaraldehyde with amine groups to form Schiff bases or Michael type double bond addition products. The yield of conjugates can be controlled by varying the pH of the reaction. Higher pH would give rise to more Schiff base intermediates and subsequently lead to the increase in hapten conjugates' number and size. Overall, cross linkage involving glutaraldehyde is very stable. However, immunized animals tend to recognize glutaraldehyde's cross linking bridges as epitopes. High performance capillary electrophoresis: High performance capillary electrophoresis (HPCE) is an alternative method in optimizing hapten protein conjugation. HPCE is predominantly used in separating carbohydrates with a very high separation capacity. There are numerous advantages to using HPCE as a technique to investigate certain conjugates such as only requiring minute sample sizes (nl). In addition, the sample used does not need to be pure and no type of radiolabeling is needed. A great benefit to this method of hapten conjugation is that there is automated analysis of sample and the testing of sample interactions can be determined in free solution. This method of hapten protein conjugation is exceptionally effective with conjugates of low epitope densities, where it is otherwise very challenging by the use of other methods to determine their electrical or ionic mobility.

Ингибирование гаптена

Ингибирование гаптена или "полугаптена" – это подавление реакции гиперчувствительности III типа. При ингибировании свободные молекулы гаптена связываются с антителами к этой молекуле, не вызывая иммунного ответа, что уменьшает количество антител, доступных для связывания с иммуногенным гаптен-белковым аддуктом. Примером ингибитора гаптена является декстран 1, представляющий собой небольшую фракцию (1 килодальтон) всего комплекса декстрана, достаточную для связывания антидекстрановых антител, но недостаточную для формирования иммунных комплексов и, как следствие, иммунного ответа.

Исследования

Гаптены широко используются в иммунологии и смежных областях. Сенсибилизирующие вещества могут вызывать различные формы аллергии, аллергический контактный дерматит или сенсибилизацию дыхательных путей. Интересно, что различные типы химических веществ индуцируют различные иммунные ответы: контактные аллергены провоцируют преимущественно реакции гиперчувствительности I типа, в то время как респираторные аллергены стимулируют селективные реакции II типа, что может быть весьма подходящим для моделирования поляризации иммунного ответа в отношении различных типов антигенов. В аллергологии на ранних этапах разработки продукта предпочтительно использование in vitro/in silico тестов для оценки сенсибилизирующего потенциала кожи, идентификации опасности и оценки эффективности различных лекарственных и косметических компонентов. Способность лекарственного средства выступать в качестве гаптена является явным признаком потенциальной иммуногенности. Антитела, специфичные к гаптенам, используются в широком спектре иммуноанализов, иммунобиосенсорных технологий и колонок иммуноаффинной хроматографии; эти антитела могут применяться для обнаружения малых загрязнителей окружающей среды, наркотических веществ, витаминов, гормонов, метаболитов, пищевых токсинов и загрязняющих веществ.