Введение

Вирус или плазмида, предназначенные для экспрессии генов в клетках.

Вектор экспрессии, также известный как экспрессионная конструкция, обычно представляет собой плазмиду или вирус, разработанный для экспрессии генов в клетках. Вектор используется для введения конкретного гена в целевую клетку и может использовать клеточные механизмы синтеза белка для производства белка, кодируемого этим геном. Векторы экспрессии являются основными инструментами в биотехнологии для производства белков. Вектор сконструирован таким образом, чтобы содержать регуляторные последовательности, действующие как энхансерные и промоторные области, обеспечивающие эффективную транскрипцию гена, переносимого вектором экспрессии. Цель хорошо спроектированного вектора экспрессии – эффективное производство белка, что достигается за счет синтеза значительного количества стабильной мРНК, которая затем транслируется в белок. Экспрессия белка может быть жестко контролируемой, и белок производится в значительном количестве только при необходимости с использованием индуктора. Однако в некоторых системах белок может экспрессироваться конститутивно. Кишечная палочка (Escherichia coli) обычно используется в качестве хозяина для производства белка, но могут применяться и другие типы клеток. Примером использования вектора экспрессии является производство инсулина, используемого для лечения диабета.

Элементы

Экспрессионный вектор обладает характеристиками, свойственными любому вектору, такими как начало репликации, селективный маркер и подходящее место для вставки гена, например, мультиклонирующий сайт. Клонированный ген может быть перенесен из специализированного клонирующего вектора в экспрессионный вектор, хотя возможно и прямое клонирование в экспрессионный вектор. Процесс клонирования обычно осуществляется в Escherichia coli. Векторы, используемые для производства белка в организмах, отличных от E. coli, могут содержать, помимо подходящего начала репликации для их размножения в E. coli, элементы, обеспечивающие их поддержание в другом организме; такие векторы называются шаттл-векторами.

Элементы для выражения

Вектор экспрессии должен содержать элементы, необходимые для экспрессии гена. К ним могут относиться промотор, корректная последовательность инициации трансляции, такая как рибосомсвязывающий участок и стартовый кодон, стоп-кодон и последовательность терминации транскрипции. Поскольку механизмы синтеза белка у прокариот и эукариот различаются, векторы экспрессии должны содержать элементы экспрессии, соответствующие выбранному организму-хозяину. Например, векторы экспрессии прокариот содержат последовательность Шайна-Дальгарно в участке инициации трансляции для связывания рибосом, а векторы экспрессии эукариот – консенсусную последовательность Козака. Промотор инициирует транскрипцию и, следовательно, является точкой контроля экспрессии клонированного гена. Промоторы, используемые в векторах экспрессии, обычно индуцируемые, то есть синтез белка инициируется только при необходимости, путем добавления индуктора, например IPTG. Однако в некоторых векторах экспрессии экспрессия гена может быть конститутивной (то есть белок постоянно экспрессируется). Даже в векторах экспрессии с жестко контролируемыми промоторами может наблюдаться низкий уровень конститутивного синтеза белка.

Белокочанные метки

После экспрессии продукта гена может потребоваться очистка экспрессированного белка; однако отделение интересующего белка от большинства белков клетки-хозяина может быть длительным процессом. Чтобы упростить процесс очистки, к клонированному гену может быть добавлен тег для очистки. Этот тег может быть гистидиновым (His) тегом, другими маркерными пептидами или белками-партнерами по слиянию, такими как глутатион S-трансфераза или белок, связывающий мальтозу. Некоторые из этих белков-партнеров по слиянию также могут способствовать увеличению растворимости экспрессируемых белков. Другие белки слияния, такие как зеленый флуоресцентный белок, могут служить ген-репортером для идентификации успешно клонированных генов или использоваться для изучения экспрессии белка при клеточной визуализации.

Другие элементы

Вектор экспрессии трансформируется или трансфицируется в клетку-хозяина для синтеза белка. Некоторые векторы экспрессии могут содержать элементы, обеспечивающие трансформацию или встраивание ДНК в хромосому клетки-хозяина, например, гены vir для трансформации растений и сайты интеграции для хромосомной интеграции. Некоторые векторы могут включать сигнальные последовательности, направляющие экспрессируемый белок в определенное местоположение, такое как периплазматическое пространство бактерий.

Системы выражения/производства

Для экспрессии белка-мишени гена могут использоваться различные организмы, поэтому вектор экспрессии будет содержать элементы, специфичные для использования в конкретном организме. Наиболее часто используемым организмом для производства белков является бактерия Escherichia coli. Однако не все белки могут быть успешно экспрессированы в E. coli, или экспрессированы с корректной формой посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, и в этом случае могут использоваться другие системы.

Бактериальные

Основным хозяином для экспрессии многих белков является Escherichia coli, поскольку производство гетерологичных белков в E. coli относительно просто, удобно, быстро и экономично. Доступно большое количество плазмид экспрессии E. coli для широкого спектра задач. Другие бактерии, используемые для производства белков, включают Bacillus subtilis. Большинство гетерологичных белков экспрессируется в цитоплазме E. coli. Однако не все образующиеся белки могут быть растворимы в цитоплазме, а неправильно свернутые белки, образующиеся в цитоплазме, могут формировать нерастворимые агрегаты, называемые телами включения. Такие нерастворимые белки потребуют рефолдинга, который может быть сложным процессом и не всегда приводит к высокой продуктивности. Белки, содержащие дисульфидные связи, часто не могут правильно сворачиваться из-за восстановительной среды в цитоплазме, которая препятствует образованию этих связей. Возможным решением является направленная доставка белка в периплазматическое пространство с использованием N-концевой сигнальной последовательности. Другой вариант – манипулирование окислительно-восстановительной средой цитоплазмы. Разрабатываются и более сложные системы, которые могут позволить экспрессию белков, ранее считавшихся невозможными для экспрессии в E. coli, таких как гликозилированные белки. Промоторы, используемые в этих векторах, обычно основаны на промоторе лакоперана или промоторе T7 и обычно регулируются лак-оператором. Эти промоторы также могут быть гибридами различных промоторов, например, промотор Tac является гибридом промоторов trp и lac. Важно отметить, что наиболее часто используемые лак-промоторы или промоторы, производные от лака, основаны на мутанте lacUV5, нечувствительном к подавлению катаболитами. Этот мутант позволяет экспрессировать белок под контролем лак-промотора, когда в питательной среде присутствует глюкоза, поскольку глюкоза ингибирует экспрессию генов при использовании промотора лака дикого типа. Тем не менее, присутствие глюкозы все же может быть использовано для снижения фоновой экспрессии за счет остаточного ингибирования в некоторых системах. Примерами векторов экспрессии E. coli являются серия векторов pGEX, в которых глутатион S-трансфераза используется в качестве партнера для слияния, а экспрессия генов контролируется промотором tac, и серия векторов pET, использующая промотор T7. Возможно одновременное экспрессировать два или более различных белка в E. coli, используя разные плазмиды. Однако при использовании двух или более плазмид каждая плазмида должна использовать различный отбор антибиотиков, а также различный источник репликации, иначе одна из плазмид может не поддерживаться стабильно. Многие широко используемые плазмиды основаны на репликаторе ColE1 и, следовательно, несовместимы друг с другом. Для того чтобы плазмида на основе ColE1 могла сосуществовать с другой в одной клетке, другая должна быть основана на другом репликаторе, например, на репликаторе p15A, таком как серия плазмид pACYC. Другой подход заключается в использовании единого двухцистронного вектора или разработке кодирующих последовательностей в тандеме в виде би- или полицистронной конструкции.

Дрожжи

Обычно для производства белка используют дрожжи Pichia pastoris. Примеры векторов экспрессии в Pichia – серия векторов pPIC, которые используют промотор AOX1, индуцируемый метанолом. Плазмиды могут содержать элементы для встраивания чужеродной ДНК в геном дрожжей и сигнальную последовательность для секреции экспрессируемого белка. Белки, содержащие дисульфидные связи и подвергающиеся гликозилированию, могут эффективно производиться в дрожжах. Другим видом дрожжей, используемым для производства белка, является Kluyveromyces lactis, где ген экспрессируется под контролем варианта сильного промотора лактазы LAC4. Saccharomyces cerevisiae особенно широко используется для изучения экспрессии генов в дрожжах, например, в двухгибридной системе для исследования белок-белковых взаимодействий. Векторы, используемые в двухгибридной системе, содержат партнеры для слияния двух клонированных генов, что позволяет транскрибировать репортерный ген при взаимодействии двух белков, экспрессируемых из этих генов.

Бакюловирус

В этой системе в качестве вектора экспрессии используется бактериовирус – палочковидный вирус, инфицирующий клетки насекомых. В качестве хозяина используются клеточные линии насекомых, полученные из чешуекрылых (мотыльков и бабочек), таких как *Spodoptera frugiperda*. Особый интерес представляет клеточная линия, полученная из капустной совки, поскольку она была разработана для быстрого роста и без дорогостоящей сыворотки, обычно необходимой для стимуляции роста клеток. Шаттл-вектор называется бакмидом, а экспрессия генов контролируется сильным промотором pPolh. Бакловирус также используется с клеточными линиями млекопитающих в системе BacMam. В этих экспрессионных векторах ДНК, предназначенная для вставки в растение, клонируется в T-ДНК – участок ДНК, фланкированный 25-парным прямым повтором на обоих концах, который может интегрироваться в геном растения. T-ДНК также содержит селективный маркер. *Agrobacterium* обеспечивает механизм трансформации, интеграции в геном растения, а промоторы его *vir*-генов также могут использоваться для клонированных генов. Однако опасения по поводу переноса бактериального или вирусного генетического материала в растение привели к разработке векторов, называемых интрагенными, в которых используются функциональные эквиваленты генома растения, чтобы исключить перенос генетического материала из чужеродного вида в растение. Растительные вирусы могут использоваться в качестве векторов, поскольку метод *Agrobacterium* не работает для всех растений. Примерами используемых растительных вирусов являются вирус табачной мозаики (TMV), вирус картофеля X и вирус мозаики бобов. Белок может экспрессироваться в виде слияния с белком оболочки вируса и отображаться на поверхности собранных вирусных частиц, либо как несвязанный белок, который накапливается внутри растения. Экспрессия в растениях с использованием растительных векторов часто является конститутивной, и широко используемым конститутивным промотором в векторах экспрессии растений является промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV).

млекопитающие

Векторы экспрессии млекопитающих предоставляют значительные преимущества для экспрессии белков млекопитающих по сравнению с бактериальными системами экспрессии, обеспечивая правильную укладку, посттрансляционные модификации и соответствующую ферментативную активность. Это также может быть предпочтительнее других эукариотических систем, не относящихся к млекопитающим, поскольку экспрессируемые в них белки могут не содержать корректных гликозилирований. Особенно полезно это при производстве мембран-ассоциированных белков, которым для правильной укладки и стабильности требуются шапероны, а также содержащих множество посттрансляционных модификаций. Однако, недостатком является более низкий выход продукта по сравнению с прокариотическими векторами, а также высокая стоимость используемых технологий. Сложность технологии и потенциальное контаминирование вирусными агентами при экспрессии в клетках млекопитающих также ограничивают его применение в крупномасштабном промышленном производстве. Для производства белка могут использоваться культивируемые клеточные линии млекопитающих, такие как яичник китайского хомяка (CHO), COS, а также линии клеток человека, такие как HEK и HeLa. Векторы трансфицируются в клетки, при этом ДНК может быть интегрирована в геном посредством гомологичной рекомбинации при стабильной трансфекции, либо клетки могут быть трансфицированы транзиторно. Примеры векторов экспрессии млекопитающих включают аденовирусные векторы, серии плазмидных векторов pSV и pCMV, вакцинные и ретровирусные векторы, а также бакуловирусы. Промоторы цитомегаловируса (CMV) и SV40 обычно используются в векторах экспрессии млекопитающих для стимуляции экспрессии генов. Также известны невирусные промоторы, такие как промотор фактора элонгации (EF) 1.

Системы без клеток

Лизат клеток E. coli, содержащий клеточные компоненты, необходимые для транскрипции и трансляции, используется в данном in vitro методе производства белка. Преимущество такой системы заключается в том, что белок может быть произведен значительно быстрее, чем при in vivo производстве, поскольку не требуется время на культивирование клеток, однако это более дорогостоящий метод. В этой системе можно использовать векторы, применяемые для экспрессии в E. coli, хотя существуют и векторы, разработанные специально для безклеточных систем. В других безклеточных системах также могут использоваться экстракты эукариотических клеток, например, системы безклеточной экспрессии зародышей пшеницы. Кроме того, разработаны системы без клеток млекопитающих.

Лабораторное использование

Вектор экспрессии в клетке-хозяине является стандартным методом, используемым в лабораториях для производства белков в исследовательских целях. Большинство белков производят в *E. coli*, но для гликозилированных белков и белков, содержащих дисульфидные связи, могут применяться дрожжи, бакуловирусы и системы млекопитающих.

Производство пептидных и белковых фармацевтических препаратов

Большинство белковых фармацевтических препаратов в настоящее время производятся с использованием технологии рекомбинантной ДНК и векторов экспрессии. Эти пептидные и белковые препараты могут быть гормонами, вакцинами, антибиотиками, антителами и ферментами. Первый рекомбинантный белок человека, используемый для лечения заболеваний, – инсулин – был представлен в 1982 году. Ранее существовал риск вирусного загрязнения фактора VIII свертывания крови, выделенного из человеческой крови, что приводило к передаче вирусных заболеваний, таких как гепатит и СПИД. Этот риск снижается или полностью устраняется при производстве белков в нечеловеческих клетках-хозяевах.

Трансгенные растения и животные

В последние годы экспрессионные векторы стали использоваться для введения специфических генов в растения и животных с целью получения трансгенных организмов, например, в сельском хозяйстве для производства трансгенных растений. Экспрессионные векторы применялись для введения прекурсора витамина А, бета-каротина, в растения риса. Этот продукт известен как «золотой рис». Данный процесс также использовался для введения гена, кодирующего инсектицид – токсин *Bacillus thuringiensis* или Bt-токсин – в растения, что снижает потребность фермеров в применении инсектицидов, поскольку инсектицид производится самим модифицированным организмом. Помимо этого, экспрессионные векторы используются для увеличения срока созревания помидоров, путем изменения растения таким образом, чтобы оно производило меньше вещества, вызывающего их гниение. Использование экспрессионных векторов для модификации сельскохозяйственных культур вызывает споры из-за потенциальных неизвестных рисков для здоровья, возможности патентования компаниями определенных генетически модифицированных пищевых культур, а также этических соображений. Тем не менее, эта технология продолжает использоваться и активно изучается. Трансгенные животные также создаются для изучения биохимических процессов у животных и заболеваний человека, или для производства фармацевтических препаратов и других белков. Их также могут модифицировать для придания им полезных или выгодных признаков. Зеленый флуоресцентный белок иногда используется в качестве метки, что приводит к способности животных флуоресцировать, и это свойство коммерчески используется, например, для производства флуоресцентных рыбок GloFish.

Генная терапия

Генная терапия — перспективный метод лечения ряда заболеваний, при котором "нормальный" ген, доставляемый вектором, встраивается в геном для замены "аномального" гена или усиления экспрессии определенного гена. Обычно используются вирусные векторы, но разрабатываются и другие, невирусные методы доставки. Лечение все еще сопряжено с риском из-за используемого вирусного вектора, который может вызывать побочные эффекты, например, инсерционные мутации, способные приводить к раку. Тем не менее, получены обнадеживающие результаты.