Женектік экспрессия үшін вирус немесе плазмида

Кіріспе

Вирус немесе плазмид, жасушаларда гендік экспрессия үшін жасалған.

Экспрессиялық вектор, сондай-ақ экспрессиялық конструкция деп те аталады, әдетте жасушаларда гендік экспрессия үшін арналған плазмид немесе вирус болып табылады. Вектор белгілі бір генді нысана жасушаға енгізу үшін қолданылады және ген кодтайтын белокты өндіру үшін жасушаның белок синтезі механизмін пайдалана алады. Экспрессиялық векторлар – биотехнологияда ақуыздарды өндірудің негізгі құралдары. Векторда экспрессиялық векторда тасымалданатын геннің тиімді транскрипциясына әкелетін, күшін арттырушы және промоторлық аймақтар ретінде әрекет ететін реттеуші тізбектер болады. Жақсы жобаланған экспрессиялық вектордың мақсаты – ақуызды тиімді өндіру, бұл тұрақты хабаршы РНК-ның жеткілікті мөлшерін өндіру арқылы мүмкін болады, содан кейін ол ақуызға аударылады. Ақуыздың экспрессиясы қатаң түрде бақылана алады, және белсендіруші (индуктор) қолданылғанда ғана маңызды мөлшерде өндіріледі, бірақ кейбір жүйелерде ақуыз конститутивті түрде экспрессияға ие болуы мүмкін. Эшерихия коли көбінесе ақуыз өндіру үшін қабылдаушы ретінде қолданылады, бірақ басқа жасуша түрлері де қолданылуы мүмкін. Экспрессиялық векторды қолданудың мысалы – қант диабетін емдеу үшін қолданылатын инсулиннің өндірісі.

Элементтер

Экспрессиялық вектор кез келген векторға тән қасиеттерге ие, мысалы, репликацияның басталуы, таңдау маркері және генді, мысалы, көп клондау орнына енгізуге қолайлы орын. Клондалған ген арнайы клондау векторынан экспрессиялық векторға көшірілуі мүмкін, бірақ экспрессиялық векторға тікелей клондау да мүмкін. Клондау процесі әдетте Escherichia coli бактериясында жүзеге асырылады. Escherichia coli емес организмдерде белок өндіруге қолданылатын векторлар, E. coli-де көбейтілуіне қолайлы репликация басталуымен қатар, оларды басқа организмде сақтауға мүмкіндік беретін элементтерге ие болуы мүмкін, мұндай векторлар шаттл-векторлар деп аталады.

Көрсеткіш элементтері

Экспрессиялық векторда ген экспрессиясына қажетті элементтер болуы керек. Оларға промотор, рибосома байланысу орны және бастау кодоны сияқты дұрыс трансляция бастау тізбегі, тоқтау кодоны және транскрипция тоқтау тізбегі кіруі мүмкін. Прокариоттар мен эукариоттар арасында ақуыз синтезінің механизмдері әртүрлі болғандықтан, экспрессиялық векторларда таңдалған жануар үшін сәйкес экспрессия элементтері болуы тиіс. Мысалы, прокариоттардың экспрессиялық векторларында рибосомалардың байланысуы үшін трансляция бастау орнында Шине-Далгарно тізбегі болады, ал эукариоттардың экспрессиялық векторларында Козак консенсустық тізбегі болады. Промотор транскрипцияны бастайды, сондықтан ол клондалған геннің экспрессиясын бақылау нүктесі болып табылады. Экспрессиялық векторларда қолданылатын промоторлар көбінесе индукцияланады, яғни ақуыз синтезі тек IPTG сияқты индуктор енгізілген кезде ғана басталады. Дегенмен, ген экспрессиясы кейбір экспрессиялық векторларда конститутивті (яғни ақуыз үнемі экспрессияланады) болуы мүмкін. Қатты бақыланатын промоторлары бар экспрессиялық векторларда да құраушы ақуыз синтезінің төмен деңгейі болуы мүмкін.

Белок белгілері

Ген өнімінің экспрессиясынан кейін, экспрессияланған белокты тазарту қажет болуы мүмкін; алайда, қызығушылық тудыратын белокты қабылдаушы жасушаның көптеген белоктарынан бөліп алу ұзаққа созылуы мүмкін. Осы тазарту процесін жеңілдету үшін клондалған генге тазалау таңбасы қосылуы мүмкін. Бұл таңба гистидин (His) таңбасы, басқа маркерлік пептидтер немесе глютатион S трансферазасы немесе мальтоза байланыстыратын белок сияқты біріктіру серіктестері болуы мүмкін. Осы біріктіру серіктестерінің кейбіреулері экспрессияланған кейбір белоктардың ерігіштігін арттыруға көмектесе алады. Жасыл флуоресцентті белок сияқты басқа біріктірілген белоктар сәтті клондалған гендерді анықтау үшін репортерлік ген ретінде қолданылуы мүмкін, немесе оларды жасушалық бейнелеуде белок экспрессиясын зерттеу үшін пайдалануға болады.

Басқа элементтер

Экспрессиялық вектор белок синтезі үшін қабылдаушы жасушаға түрлендіріледі немесе трансфекцияланады. Кейбір экспрессиялық векторларда трансформацияға немесе қабылдаушы хромосомасына ДНҚ енгізуге арналған элементтер болуы мүмкін, мысалы, өсімдіктерді трансформациялау үшін vir гендері және хромосомалық интеграция үшін интеграза сайттары. Кейбір векторларда экспрессияланған белокты бактериялардың периплазмалық кеңістігі сияқты белгілі бір жерге бағыттайтын бағыттаушы тізбектер болуы мүмкін.

Экспрессия/өндіру жүйелері

Әр түрлі организмдер геннің мақсатты ақуызын өндіру үшін қолданылуы мүмкін, сондықтан қолданылатын экспрессия векторында нақты организмде пайдалануға арналған ерекше элементтер болады. Ақуыз өндірісі үшін ең көп қолданылатын организм – Escherichia coli бактериясы. Дегенмен, барлық ақуыздарды E. coli-да сәтті өндіруге немесе гликозилдеу сияқты посттрансляциялық модификациялардың дұрыс түрімен өндіруге болмайды, сондықтан басқа жүйелер қолданылуы мүмкін.

Бактериялық

Көптеген ақуыздарды экспрессиялау үшін таңдалған хост – Escherichia coli, себебі E. coli-де гетерологты ақуыз өндіру салыстырмалы түрде қарапайым және ыңғайлы, сонымен қатар жылдам және арзан. E. coli экспрессиялық плазмидтерінің көп саны әртүрлі қажеттіліктер үшін қолжетімді. Ақуыз өндіру үшін қолданылатын басқа бактериялар Bacillus subtilis-ті қамтиды. Көптеген гетерологты ақуыздар E. coli цитоплазмасында экспрессияланады. Дегенмен, барлық ақуыздар цитоплазмада ерігіш болуы міндетті емес, ал цитоплазмада дұрыс бүктелмеген ақуыздар инклюзиялық денелер деп аталатын ерімейтін агрегаттарды құрауы мүмкін. Мұндай ерімейтін ақуыздарды қайта бүктеу қажет, бұл күрделі процесс болуы мүмкін және міндетті түрде жоғары өнімділікке әкелмейді. Дисульфидтік байланыстары бар ақуыздар цитоплазмадағы тотығу ортасының әсерінен дұрыс бүктеле алмайды, себебі бұл орта байланыс пайда болуына кедергі келтіреді. Мүмкін болатын шешім – N-терминалды сигналдық тізбек арқылы ақуызды периплазмалық кеңістікке бағыттау. Тағы бір мүмкіндік – цитоплазманың тотығу ортасын өзгерту. Басқа да күрделі жүйелер әзірленуде; мұндай жүйелер бұрын E. coli-де экспрессиялау мүмкін емес деп саналған, мысалы гликозильденген ақуыздар сияқты ақуыздарды экспрессиялауға мүмкіндік беруі мүмкін. Бұл векторлар үшін қолданылатын промоторлар әдетте lac оперонының промоторына немесе T7 промоторына негізделген, және олар әдетте lac операторымен реттеледі. Бұл промоторлар әртүрлі промоторлардың гибридтері болуы мүмкін, мысалы, Tac промоторы trp және lac промоторларының гибриді болып табылады. Есте сақтаңыз, көбінесе қолданылатын lac немесе lac-тан туындаған промоторлар катаболиттік репрессияға сезімтал емес lacUV5 мутантына негізделген. Бұл мутант өсу ортасында глюкоза болғанда да lac промоторының бақылауымен ақуыз экспрессиясын қамтамасыз етеді, себебі глюкоза жабайы типті lac промоторы қолданылғанда ген экспрессиясын тежейді. Глюкозаның болуы кейбір жүйелерде қалдық тежелім арқылы фондық экспрессияны азайту үшін де қолданылуы мүмкін. E. coli экспрессиялық векторларының мысалдары – pGEX сериясы, онда глутатион S трансферазасы синтез серіктесі ретінде қолданылады және ген экспрессиясы tac промоторының бақылауында болады, сондай-ақ pET сериясы, ол T7 промоторын пайдаланады. E. coli-де әртүрлі плазмидтерді пайдалана отырып, екі немесе одан да көп әртүрлі ақуыздарды бір мезгілде экспрессиялау мүмкін. Алайда, екі немесе одан да көп плазмид қолданылған жағдайда, әрбір плазмидтің антибиотикпен таңдауы әртүрлі болуы керек, сондай-ақ репликацияның басталуы да әртүрлі болуы керек, әйтпесе плазмидтердің бірі тұрақты сақталмауы мүмкін. Көптеген кең таралған плазмидтер ColE1 репликонына негізделген, сондықтан олар бір-бірімен үйлесімсіз; ColE1 плазмидінің бір жасушада басқа плазмидпен бірге өмір сүруі үшін, екінші плазмидтің басқа репликон болуы керек, мысалы, p15A репликонына негізделген плазмид, мысалы, pACYC сериясының плазмидтері. Тағы бір тәсіл – екі цистронды бір векторды пайдалану немесе кодтау тізбектерін екі немесе көп цистронды құрылым ретінде біріктіру.

The expression host of choice for the expression of many proteins is Escherichia coli as the production of heterologous protein in E. coli is relatively simple and convenient, as well as being rapid and cheap. A large number of E. coli expression plasmids are also available for a wide variety of needs. Other bacteria used for protein production include Bacillus subtilis. Most heterologous proteins are expressed in the cytoplasm of E. coli. However, not all proteins formed may be soluble in the cytoplasm, and incorrectly folded proteins formed in cytoplasm can form insoluble aggregates called inclusion bodies. Such insoluble proteins will require refolding, which can be an involved process and may not necessarily produce high yield. Proteins which have disulphide bonds are often not able to fold correctly due to the reducing environment in the cytoplasm which prevents such bond formation, and a possible solution is to target the protein to the periplasmic space by the use of an N terminal signal sequence. Another possibility is to manipulate the redox environment of the cytoplasm. Other more sophisticated systems are also being developed; such systems may allow for the expression of proteins previously thought impossible in E. coli, such as glycosylated proteins. The promoters used for these vector are usually based on the promoter of the lac operon or the T7 promoter, and they are normally regulated by the lac operator. These promoters may also be hybrids of different promoters, for example, the Tac Promoter is a hybrid of trp and lac promoters. Note that most commonly used lac or lac derived promoters are based on the lacUV5 mutant which is insensitive to catabolite repression. This mutant allows for expression of protein under the control of the lac promoter when the growth medium contains glucose since glucose would inhibit gene expression if wild type lac promoter is used. Presence of glucose nevertheless may still be used to reduce background expression through residual inhibition in some systems. Examples of E. coli expression vectors are the pGEX series of vectors where glutathione S transferase is used as a fusion partner and gene expression is under the control of the tac promoter, and the pET series of vectors which uses a T7 promoter. It is possible to simultaneously express two or more different proteins in E. coli using different plasmids. However, when 2 or more plasmids are used, each plasmid needs to use a different antibiotic selection as well as a different origin of replication, otherwise one of the plasmids may not be stably maintained. Many commonly used plasmids are based on the ColE1 replicon and are therefore incompatible with each other; in order for a ColE1 based plasmid to coexist with another in the same cell, the other would need to be of a different replicon, e. g. a p15A replicon based plasmid such as the pACYC series of plasmids. Another approach would be to use a single two cistron vector or design the coding sequences in tandem as a bi or poly cistronic construct.

Ашытқы

Белсенділерді өндіру үшін жиі қолданылатын ашытқы – Pichia pastoris. Пичиядағы ашытқы экспрессиялық векторларының мысалы – pPIC сериялы векторлар, және бұл векторлар метанолмен индукцияланатын AOX1 промоторын пайдаланады. Плазмидалар ашытқы геномына бөгде ДНК енгізуге арналған элементтерді және экспрессияланған белоктың секрециясы үшін сигналдық тізбектерді қамтуы мүмкін. Дисульфидтік байланыстары және гликозилдеуі бар белоктар ашытқыда тиімді өндіріледі. Белсенді өндіру үшін қолданылатын тағы бір ашытқы – Kluyveromyces lactis, ал ген күшті ЛАК4 лактаза промоторының нұсқасы арқылы экспрессияланады. Saccharomyces cerevisiae, әсіресе, ашытқыда ген экспрессиясын зерттеуде кеңінен қолданылады, мысалы, белок-белок өзара әрекеттесуін зерттеу үшін ашытқы екі гибридтік жүйесінде. Ашытқы екі гибридтік жүйесінде қолданылатын векторларда екі клондалған ген үшін біріктіру серіктестері бар, олар клондалған гендерден экспрессияланатын екі белок арасында өзара әрекеттесу болған кезде репортер генінің транскрипциясына мүмкіндік береді.

Бакуловирус

Бұл жүйеде экспрессия векторы ретінде жәндік жасушаларын жұқтыратын таяқша тәрізді вирусты – бакуловирусты қолданады. Spodoptera frugiperda сияқты Lepidopterans (күлділер мен көбелектер) -ден алынған жәндік жасушалары қабылдаушы ретінде қолданылады. Капуста шөбінен алынған жасуша желісі ерекше қызығушылық тудырады, себебі ол тез өсуге және жасуша өсуін күшейту үшін әдетте қажет болатын қымбат сарысусыз өсуге дамытылған. Шаттл векторы бакмид деп аталады, ал гендік экспрессия күшті промотор pPolh бақылауында жүзеге асырылады. Бакловирус BacMam жүйесінде сүтқоректілердің жасушалық желілерімен де қолданылған. Бұл экспрессиялық векторларда өсімдікке енгізілетін ДНК Т-ДНҚ-ға клондалады, ол екі жағынан 25 жұп негіздік тікелей қайталама тізбектермен шектелген және өсімдік геномға интеграциялана алады. Т-ДНҚ-да таңдаулы маркер де бар. Agrobacterium трансформация механизмін қамтамасыз етеді, өсімдік геномға интеграциялануға және оның vir гендерінің промоторлары клондалған гендер үшін де қолданылуы мүмкін. Бактериялық немесе вирустық генетикалық материалды өсімдікке беру туралы алаңдаушылықтар өсімдіктің геномдарының функционалдық эквиваленттерін пайдаланатын, сондықтан шетелдік түрден генетикалық материалдың өсімдікке түсуі болмайтын интрагендік векторлар деп аталатын векторлардың дамуына әкелді. Agrobacterium әдісі барлық өсімдіктер үшін жұмыс істемейтіндіктен, өсімдік вирустарын вектор ретінде пайдалануға болады. Өсімдік вирустарының мысалдары темекі мозаика вирусы (TMV), картоп вирусы X және бұршақ мозаика вирусы болып табылады. Ақуыз вирустың қабықша ақуызымен біріктіріліп экспрессиялануы мүмкін және жиналған вирустық бөлшектердің бетінде немесе өсімдік ішінде жиналатын біріктірілмеген ақуыз ретінде көрсетіледі. Өсімдік векторларын пайдаланатын өсімдіктердегі экспрессия көбінесе конститутивті болып табылады, ал өсімдік экспрессиясы векторларында жиі қолданылатын конститутивті промотор – гүлдесте мозаика вирусының (CaMV) 35S промоторы.

сүтқоректілер

Сүтқоректілердің экспрессиялық векторлары бактериялық экспрессиялық жүйелерге қарағанда сүтқоректілердің ақуыздарын экспрессиялауда маңызды артықшылықтар ұсынады – дұрыс бүгілуі, трансляциядан кейінгі модификациялар және тиісті ферменттік белсенділік. Бұл басқа еукариоттық, сүтқоректі емес жүйелерге қарағанда артықшылықты болып табылады, себебі экспрессияланатын ақуыздарда дұрыс гликозилдеулер болмауы мүмкін. Бұл, әсіресе, дұрыс бүгілуі мен тұрақтылығы үшін шаперон қажет болатын және көптеген трансляциядан кейінгі модификацияларды қамтитын мембранамен байланысты ақуыздарды өндіруде өте пайдалы. Дегенмен, кемшілігі – прокариоттық векторлармен салыстырғанда өнімнің төмен болуы және қолданылатын техникалардың қымбаттығы. Оның күрделі технологиясы, сондай-ақ сүтқоректі жасушаларының экспрессиясында жануар вирустарымен болуы мүмкін ластану кең ауқымды өнеркәсіптік өндірісте қолдануын шектейді. Қытай хомягының жасушалары (CHO), COS және HEK, HeLa сияқты адам жасушаларының желілері ақуыз өндіру үшін қолданылуы мүмкін. Векторлар жасушаларға трансфекцияланады, ДНК тұрақты трансфекция кезінде гомологиялық рекомбинация арқылы геномға енгізілуі мүмкін, немесе жасушалар уақытша трансфекцияланады. Сүтқоректілердің экспрессиялық векторларына аденовирустық векторлар, pSV және pCMV плазмидтік векторларының сериясы, вакциния және ретровирустық векторлар, сондай-ақ бакуловирус жатады. Цитомегаловирустың (CMV) және SV40 промоторлары сүтқоректілердің экспрессиялық векторларында ген экспрессиясын қозғау үшін жиі қолданылады. Вирустық емес промоторлар, мысалы, ұзарту факторының (EF) 1 промоторы да белгілі.

Ұяшықтан бос жүйелер

Бұл ин витро протеин өндіру әдісінде транскрипция және трансляцияға қажетті жасушалық компоненттерді қамтитын E. coli жасуша лизаты қолданылады. Мұндай жүйенің артықшылығы – протеин өндірісі тірі жасушалардағыдан (in vivo) әлдеқайда жылдам, себебі жасушаларды өсіруге уақыт кетірмейді, бірақ бұл әдіс қымбатқа соғады. E. coli экспрессиясы үшін қолданылатын векторларды осы жүйеде пайдалануға болады, сонымен қатар осы жүйеге арналған арнайы векторлар да бар. Эукариоттық жасушалардың экстракттары басқа жасушасыз жүйелерде де қолданылуы мүмкін, мысалы, бидай тұқымының жасушасыз экспрессиялық жүйелері. Сүтқоректілердің жасушасыз жүйелері де жасалған.

Зертханалық пайдалану

Экспрессиялық иесі бар экспрессиялық вектор қазір зертханаларда зерттеу мақсатында ақуыздарды өндірудің қалыпты әдісі болып табылады. Көптеген ақуыздар E. coli бактериясында өндіріледі, бірақ гликозильденген ақуыздар және дисульфидтік байланыстары бар ақуыздар үшін ашытқы, бакуловирус және сүтқоректілер жүйелері пайдаланылуы мүмкін.

Пептидтер мен ақуыздық дәрілік заттар өндірісі

Қазіргі кезде көптеген ақуыздық фармацевтикалық препараттар рекомбинантты ДНҚ технологиясы арқылы, экспрессиялық векторларды қолдана отырып өндіріледі. Бұл пептидтік және ақуыздық препараттар гормондар, вакциналар, антибиотиктер, антиденелер және ферменттер болуы мүмкін. Ауруларды басқару үшін қолданылған алғашқы адам рекомбинантты ақуызы – инсулин 1982 жылы енгізілді. Бұрын адам қаннан бөлініп алынған VIII фактордың құрамындағы вирус жұқпалары гепатит және ЖИТС сияқты вирустық аурулардың таралуына себеп болған. Ақуыздар адам емес жасушаларда өндірілген кезде бұл тәуекел азаяды немесе толығымен жойылады.

Трансгендік өсімдіктер мен жануарлар

Соңғы жылдары экспрессиялық векторлар өсімдіктер мен жануарларға белгілі бір гендерді енгізу арқылы трансгенді организмдерді жасау үшін қолданылды. Мысалы, ауыл шаруашылығында трансгенді өсімдіктерді өндіру үшін де пайдаланылады. Экспрессиялық векторлар А витаминінің алды – бета-каротинді күріш өсімдіктеріне енгізуге мүмкіндік берді. Бұл өнім "алтын күріш" деп аталады. Осы процестің көмегімен өсімдіктерге инсектицид өндіретін ген енгізілді, ол Bacillus thuringiensis токсині немесе Bt токсині деп аталады. Бұл фермерлердің инсектицидтерді қолдану қажеттілігін азайтады, себебі инсектицид өзгертілген организммен өндіріледі. Сонымен қатар, экспрессиялық векторлар помидордың пісу мерзімін ұзарту үшін қолданылады, өсімдіктің помидорды шірітуге себеп болатын химиялық затты аз өндіруге өзгертеді. Өсімдіктерді модификациялау үшін экспрессиялық векторларды қолдануға қатысты пікір қақтығыстары туындады, себебі денсаулыққа қатысты белгісіз тәуекелдер, компаниялардың генетикалық түрлендірілген азық-түлік дақылдарын патенттеу мүмкіндігі және этикалық мәселелер бар. Дегенмен, бұл техника әлі де қолданылуда және қарқынды зерттелуде. Трансгенді жануарлар жануарлардың биохимиялық процестерін және адам ауруларын зерттеу үшін, сондай-ақ фармацевтикалық препараттар мен басқа да ақуыздарды өндіру үшін жасалды. Олар пайдалы немесе қажетті қасиеттерге ие болу үшін де гендік инженерлік жасалуы мүмкін. Жасыл флуоресцентті ақуыз кейде жануарларды флуоресценттеуге мүмкіндік беретін маркер ретінде қолданылады, және бұл қасиет коммерциялық мақсатта флуоресцентті GloFish өндіру үшін пайдаланылды.

Гендік терапия

Гендік терапия – бірқатар ауруларды емдеудің үміт беретін әдісі, онда вектор арқылы жеткізілетін "қалыпты" ген геномға енгізіліп, "аномалды" генді алмастыруға немесе белгілі бір геннің экспрессиясын күшейтуге мүмкіндік береді. Көбінесе вирустық векторлар қолданылады, бірақ вирустық емес басқа жеткізу әдістері де жасалып жатыр. Вирустық вектордың қолданылуына байланысты емдеу әлі де тәуекелді, себебі ол жағымсыз салдарларға әкелуі мүмкін, мысалы, инсерциялық мутация туындатып, қатерлі ісікке соқтыруы мүмкін. Дегенмен, үміттендіретін нәтижелер де бар.