Введение
Вид водорослей
Chlamydomonas reinhardtii – одноклеточная зеленая водоросль диаметром около 10 микрометров, плавающая с помощью двух жгутиков. Она имеет клеточную стенку, состоящую из гликопротеинов, богатых гидроксипролином, крупный хлоропласт чашевидной формы, большой пиреноид и светочувствительное пятно (глазко). Виды Chlamydomonas широко распространены по всему миру в почве и пресной воде, при этом Chlamydomonas reinhardtii является одним из наиболее распространенных и широко встречающихся видов. Название вида писалось по-разному из-за различных транслитераций с русского языка: reinhardi, reinhardii и reinhardtii – все они относятся к одному и тому же виду, C. reinhardtii Dangeard.
Описание
Клетки Chlamydomonas reinhardtii в основном сферические, но могут иметь форму эллипсоида, яйца, перевернутого яйца или быть асимметричными. Их длина составляет 10–22 мкм, а ширина – 8–22 мкм. Клеточная стенка тонкая, без папиллы. Жгутики в 1,5–2 раза превышают длину тела клетки. В клетках содержится один чашеобразный хлоропласт, выстилающий дно клетки, с одним базальным пиреноидом.
Пятно на глазу
C. reinhardtii имеет глазное пятно, сходное с таковым у динофлагеллят. Глазное пятно расположено вблизи экватора клетки. Оно состоит из слоя гранул, богатых каротиноидами, в хлоропласте, который действует как светоотражатель. Основная функция глазного пятна – фототаксис, заключающийся в движении (с помощью жгутиков) в ответ на световой стимул. Фототаксис имеет решающее значение для водоросли и позволяет ей находить среду с оптимальными световыми условиями для фотосинтеза. Фототаксис может быть положительным или отрицательным в зависимости от интенсивности света. Channelrhodopsin 1 и Channelrhodopsin 2, белки, функционирующие как светочувствительные катионные каналы, были впервые выделены из C. reinhardtii. Эти белки и другие подобные им все шире используются в области оптогенетики.
Митохондриальное значение
Геном C. reinhardtii важен для изучения митохондрий, так как это один из видов, у которого гены для 6 из 13 белков, кодируемых митохондриями, находятся в ядре клетки, а 7 – в самих митохондриях. У всех остальных видов эти гены представлены исключительно в митохондриях и не могут быть экспрессированы аллотопически. Это имеет значение для тестирования и разработки терапий при генетических митохондриальных заболеваниях.
Размножение
Вегетативные клетки вида *Reinhardtii* гаплоидны и содержат 17 небольших хромосом. При недостатке азота вегетативные клетки дифференцируются в гаплоидные гаметы. Существуют два типа спаривания, внешне идентичные, то есть изогамные, известные как mt(+) и mt(-), которые могут сливаться, образуя диплоидную зиготу. Зигота не имеет жгутиков и служит покоящейся формой вида в почве. На свету зигота подвергается мейозу и высвобождает четыре жгутиковые гаплоидные клетки, которые возобновляют вегетативный цикл развития. В оптимальных условиях роста клетки иногда могут пройти два или три раунда митоза, прежде чем дочерние клетки будут высвобождены из старой клеточной стенки в среду. Таким образом, один этап роста может привести к образованию 4 или 8 дочерних клеток на одну материнскую клетку. Цикл клеток этих одноклеточных зеленых водорослей можно синхронизировать, чередуя периоды освещения и темноты. Фаза роста зависит от света, в то время как после определенной точки, называемой точкой перехода или коммитмента, процессы становятся не зависящими от света.
Генетика
Привлекательность водорослей как модельного организма в последнее время возросла благодаря появлению в общественном доступе нескольких геномных ресурсов. Проект Chlre3 ядерной последовательности генома Chlamydomonas, подготовленный Объединенным институтом генома Министерства энергетики США, включает 1557 контигов общей длиной 120 Мб. Примерно половина генома содержится в 24 контигах, каждый из которых имеет длину не менее 1,6 Мб. Текущая сборка ядерного генома доступна в сети Интернет. Митохондриальный геном размером ~15,8 Кб (номер доступа в базе данных: NC 001638) доступен онлайн в базе данных NCBI. Полный геном хлоропласта размером ~203,8 Кб (номер доступа в базе данных: NC 005353) также доступен онлайн. Помимо данных о геномной последовательности, имеется большой объем данных о последовательности экспрессии, доступных в виде библиотек кДНК и экспрессированных тегов последовательности (EST). Семь библиотек кДНК доступны в сети Интернет. Библиотеку BAC можно приобрести в Институте геномики Университета Клемсона. В Интернете также доступны две базы данных, содержащие более 50 000 и более 160 000 EST. Обширная коллекция мутантов с картированными местами вставки, охватывающая большинство ядерных генов, доступна по адресу: https://www.chlamylibrary.org/. Было показано, что геном C. reinhardtii содержит N6-метилдеоксиаденозин (6mA), модификацию, распространенную у прокариот, но гораздо более редкую у эукариот. Некоторые исследования указывают на то, что 6mA в Chlamydomonas может быть вовлечен в позиционирование нуклеосом, поскольку он присутствует в линкерных областях между нуклеосомами, а также вблизи сайтов начала транскрипции активно транскрибируемых генов. C. reinhardtii, по-видимому, способен осуществлять несколько процессов репарации ДНК, включая рекомбинационный ремонт, ремонт разрывов цепей и эксцизионный ремонт.
Экспериментальная эволюция
Хламидомонасы использовались для изучения различных аспектов эволюционной биологии и экологии. Это организм выбора для многих селекционных экспериментов, поскольку (1) у него короткое время генерации, (2) он является как автотрофом, так и факультативным гетеротрофом, (3) он может размножаться как половым, так и бесполым путем, и (4) уже накоплено большое количество генетической информации. Некоторые примеры (неполные) эволюционных исследований с использованием Chlamydomonas включают эволюцию полового размножения, влияние мутаций на приспособленность и эффект адаптации к различным уровням CO2. Согласно одной часто цитируемой теоретической гипотезе, половое размножение (в отличие от бесполого) адаптивно поддерживается в благоприятных условиях, поскольку оно снижает мутационную нагрузку, объединяя вредные мутации из разных линий, и повышает среднюю приспособленность. Однако в долгосрочном экспериментальном исследовании C. reinhardtii были получены данные, противоречащие этой гипотезе. В половых популяциях не было обнаружено очистки от мутаций и повышения приспособленности.
Предложение
C. reinhardtii плавает благодаря двум жгутикам, совершая движения, аналогичные человеческому брассу. Повторяя это элементарное движение 50 раз в секунду, водоросли достигают средней скорости 70 мкм/с; генетическое разнообразие различных штаммов обуславливает широкий диапазон значений этой величины. После нескольких секунд прямолинейного движения асинхронное биение двух жгутиков приводит к случайному изменению направления, которое называется "бег и кувырок".
Методы трансформации ДНК
Генотрансформация происходит главным образом посредством гомологичной рекомбинации в хлоропласте и гетерологичной рекомбинации в ядре. Геном хлоропласта *C. reinhardtii* можно трансформировать с помощью бомбардировки микрочастицами или агитации стеклянными бусинами, однако последний метод значительно менее эффективен. Ядерный геном был трансформирован как с помощью агитации стеклянными бусинами, так и электропорацией. Биолистическая процедура представляется наиболее эффективным способом введения ДНК в геном хлоропласта, вероятно, потому что хлоропласт занимает более половины объема клетки, предоставляя микрочастице большую цель. Показано, что электропорация является наиболее эффективным способом введения ДНК в ядерный геном, с максимальными частотами трансформации, на два порядка превышающими те, что достигаются при использовании метода стеклянных бусин.
Производство биофармацевтических препаратов
Генетически модифицированный C. reinhardtii использовался для производства сывороточного амилоидного белка млекопитающих (требуется ссылка), белка человеческих антител (требуется ссылка), человеческого фактора роста эндотелия сосудов, потенциальной терапевтической вакцины против вируса папилломы человека 16 типа, потенциальной вакцины против малярии (съедобной водорослевой вакцины) и сложного препарата, разработанного для лечения рака.
Альтернативный источник белка
C. reinhardtii рассматривается как новый источник питательных веществ на основе водорослей. По сравнению с Chlorella и Spirulina, у C. reinhardtii было обнаружено больше альфа-линоленовой кислоты и меньшее содержание тяжелых металлов, при этом она содержит все незаменимые аминокислоты и сопоставимое количество белка. Компания Triton Algae Innovations разрабатывала коммерческий альтернативный белковый продукт из C. reinhardtii.
Чистый источник производства водорода
В 1939 году немецкий исследователь Ханс Гафрон (1902–1979), который в то время работал в Чикагском университете, обнаружил метаболизм водорода у одноклеточных зеленых водорослей. *C. reinhardtii* и некоторые другие зеленые водоросли могут при определенных условиях прекратить выработку кислорода и вместо этого переключиться на выработку водорода. Эта реакция, катализируемая гидрогеназой – ферментом, активным только в отсутствие кислорода, – кратковременна. В течение последующих тридцати лет Гафрон и его команда изучили основные механизмы фотосинтетического производства водорода водорослями. Для увеличения производства водорода исследователи преследуют несколько направлений. Первое – разъединение гидрогеназы и фотосинтеза. Это позволяет избежать ингибирования выработки водорода накоплением кислорода. И, сделав еще один шаг, изменив структуру фермента гидрогеназы, можно сделать ее нечувствительной к кислороду, что обеспечит непрерывное производство водорода. В этом случае поток электронов, необходимый для этого процесса, поступает не от производства сахаров, а от расщепления собственных запасов крахмала. Второе направление – временная остановка процесса фотосинтеза посредством генетической модификации гидрогеназы. Это препятствует достижению кислородом концентрации, при которой он способен остановить выработку водорода. Третье направление, в основном исследованное учеными в 1950-х годах, – химические или механические методы удаления O2, образующегося в результате фотосинтетической активности клеток водорослей. К ним относятся добавление акцепторов кислорода, использование дополнительных восстановителей и продувка культур инертными газами. Однако эти методы не масштабируемы и могут быть неприменимы в практических системах. Появились новые исследования по удалению кислорода из культур водорослей, которые могут решить проблемы масштабирования. Исследуется четвертое направление – использование солей меди для разъединения действия гидрогеназы и выработки кислорода. Пятое направление предполагает перенаправление потока фотосинтезных электронов от фиксации CO2 в цикле Кальвина к гидрогеназе путем воздействия кратковременными световыми импульсами на анаэробные водоросли или истощения культуры CO2.