Трансформация бактерий: поглощение и интеграция генетического материала.

Введение

Генетическое изменение клетки путем поглощения генетического материала из окружающей среды

В молекулярной биологии и генетике трансформация – это генетическое изменение клетки, возникающее в результате непосредственного поглощения и включения экзогенного генетического материала из окружающей среды через клеточные мембраны. Для осуществления трансформации бактерия-реципиент должна находиться в состоянии компетентности, которое может возникать в природе как временный ответ на условия окружающей среды, такие как недостаток питательных веществ и плотность клеток, а также может быть индуцировано в лабораторных условиях. При трансформации генетический материал проходит через внешнюю среду, и поглощение полностью зависит от бактерии-реципиента.

История

Трансформация бактерий была впервые продемонстрирована в 1928 году британским бактериологом Фредериком Гриффитом. Гриффит был заинтересован в определении, можно ли использовать инъекции убитых нагреванием бактерий для вакцинации мышей против пневмонии. Однако он обнаружил, что не вирулентный штамм Streptococcus pneumoniae может стать вирулентным после контакта с убитыми нагреванием вирулентными штаммами. Гриффит предположил, что некий "преобразующий принцип" из убитого нагреванием штамма отвечает за приобретение безвредным штаммом вирулентности. В 1944 году Освальд Эйвери, Колин МакЛеод и Маклин Маккарти идентифицировали этот "преобразующий принцип" как генетический материал. Они изолировали ДНК из вирулентного штамма S. pneumoniae и, используя только эту ДНК, смогли превратить безвредный штамм в вирулентный. Они назвали этот процесс поглощения и включения ДНК бактериями "трансформацией" (см. эксперимент Эйвери-МакЛеода-МакКарти). Результаты экспериментов Эйвери и соавторов первоначально были встречены с недоверием в научном сообществе, и лишь после разработки генетических маркеров и открытия других методов генетической передачи (конъюгации в 1947 году и трансдукции в 1953 году) Джошуа Ледербергом эксперименты Эйвери были признаны. Первоначально считалось, что Escherichia coli, широко используемый лабораторный организм, невосприимчив к трансформации. Однако в 1970 году Мортон Мандель и Акико Хига показали, что E. coli можно индуцировать к поглощению ДНК из бактериофага λ без использования вспомогательного фага после обработки раствором хлорида кальция. Два года спустя, в 1972 году, Стэнли Норман Коэн, Энни Чанг и Лесли Хсу показали, что эта обработка также эффективна для трансформации плазмидной ДНК. Метод трансформации, разработанный Манделем и Хигой, впоследствии был усовершенствован Дугласом Ханаханом. Открытие искусственно индуцированной компетентности у E. coli создало эффективную и удобную процедуру трансформации бактерий, что позволило упростить методы молекулярного клонирования в биотехнологии и исследованиях, и теперь это стандартная лабораторная процедура. Трансформация с использованием электропорации была разработана в конце 1980-х годов, что повысило эффективность трансформации in vitro и увеличило число штаммов бактерий, которые можно трансформировать. Также была исследована трансформация клеток животных и растений, и в 1982 году была создана первая трансгенная мышь путем инъекции гена гормона роста крысы в эмбрион мыши. В 1897 году была обнаружена бактерия Agrobacterium tumefaciens, вызывающая опухоли растений, а в начале 1970-х годов было установлено, что опухолевым агентом является ДНК-плазмида, называемая Ti-плазмидой. Удаляя гены в плазмиде, вызывающие опухоль, и добавляя новые гены, исследователи смогли заражать растения A. tumefaciens и позволить бактериям встраивать выбранную ими ДНК в геномы растений. Не все растительные клетки восприимчивы к инфекции A. tumefaciens, поэтому были разработаны другие методы, включая электропорацию и микроинъекцию. Бомбардировка частицами стала возможной благодаря изобретению Джоном Санфордом в 1980-х годах системы доставки биолистических частиц (генного пистолета).

Transformation in bacteria was first demonstrated in 1928 by the British bacteriologist Frederick Griffith. Griffith was interested in determining whether injections of heat killed bacteria could be used to vaccinate mice against pneumonia. However, he discovered that a non virulent strain of Streptococcus pneumoniae could be made virulent after being exposed to heat killed virulent strains. Griffith hypothesized that some "transforming principle" from the heat killed strain was responsible for making the harmless strain virulent. In 1944 this "transforming principle" was identified as being genetic by Oswald Avery, Colin MacLeod, and Maclyn McCarty. They isolated DNA from a virulent strain of S. pneumoniae and using just this DNA were able to make a harmless strain virulent. They called this uptake and incorporation of DNA by bacteria "transformation" (See Avery MacLeod McCarty experiment) The results of Avery et al. 's experiments were at first skeptically received by the scientific community and it was not until the development of genetic markers and the discovery of other methods of genetic transfer (conjugation in 1947 and transduction in 1953) by Joshua Lederberg that Avery's experiments were accepted. It was originally thought that Escherichia coli, a commonly used laboratory organism, was refractory to transformation. However, in 1970, Morton Mandel and Akiko Higa showed that E. coli may be induced to take up DNA from bacteriophage λ without the use of helper phage after treatment with calcium chloride solution. Two years later in 1972, Stanley Norman Cohen, Annie Chang and Leslie Hsu showed that treatment is also effective for transformation of plasmid DNA. The method of transformation by Mandel and Higa was later improved upon by Douglas Hanahan. The discovery of artificially induced competence in E. coli created an efficient and convenient procedure for transforming bacteria which allows for simpler molecular cloning methods in biotechnology and research, and it is now a routinely used laboratory procedure. Transformation using electroporation was developed in the late 1980s, increasing the efficiency of in vitro transformation and increasing the number of bacterial strains that could be transformed. Transformation of animal and plant cells was also investigated with the first transgenic mouse being created by injecting a gene for a rat growth hormone into a mouse embryo in 1982. In 1897 a bacterium that caused plant tumors, Agrobacterium tumefaciens, was discovered and in the early 1970s the tumor inducing agent was found to be a DNA plasmid called the Ti plasmid. By removing the genes in the plasmid that caused the tumor and adding in novel genes, researchers were able to infect plants with A. tumefaciens and let the bacteria insert their chosen DNA into the genomes of the plants. Not all plant cells are susceptible to infection by A. tumefaciens, so other methods were developed, including electroporation and micro injection. Particle bombardment was made possible with the invention of the Biolistic Particle Delivery System (gene gun) by John Sanford in the 1980s.

Определения

Трансформация – одна из трех форм горизонтального переноса генов, происходящих в природе среди бактерий, при которой ДНК, кодирующая определенный признак, передается от одной бактерии к другой и интегрируется в геном реципиента посредством гомологичной рекомбинации; две другие формы – трансдукция, осуществляемая посредством бактериофага, и конъюгация, при которой ген передается при прямом контакте между бактериями. Она также изучалась у грамотрицательных видов, обитающих в почве, таких как Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter baylyi, и у грамотрицательных растительных патогенов, таких как Ralstonia solanacearum и Xylella fastidiosa. О трансформации сообщалось как минимум у 30 видов Pseudomonadota, относящихся к нескольким различным классам. Наиболее изученными представителями Pseudomonadota в отношении трансформации являются медицински значимые человеческие патогены Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae и Helicobacter pylori. Через мембрану может проходить только одноцепочечная ДНК, при этом другая цепь деградирует под действием нуклеаз. Транслоцированная одноцепочечная ДНК затем может быть интегрирована в бактериальные хромосомы посредством RecA-зависимого процесса. В грамотрицательных клетках, из-за наличия дополнительной мембраны, для проникновения ДНК требуется канал, образованный секретинами во внешней мембране. Пилин может быть необходим для приобретения компетентности, но его роль остается неясной. Поглощение ДНК обычно не зависит от последовательности, хотя у некоторых видов наличие специфических последовательностей для поглощения ДНК может способствовать эффективному захвату ДНК.

Естественная трансформация

Природная трансформация – это бактериальная адаптация для переноса ДНК, зависящая от экспрессии многочисленных бактериальных генов, продукты которых, по-видимому, отвечают за этот процесс. ДНК, интегрированная в хромосому хозяина, обычно (но с редкими исключениями) происходит от другой бактерии того же вида и, следовательно, гомологична резидентной хромосоме. У B. subtilis длина переносимой ДНК превышает 1271 кб (более 1 миллиона пар оснований). Переносимая длина, вероятно, представляет собой двухцепочечную ДНК и часто составляет более трети от общей длины хромосомы в 4215 кб. По-видимому, около 7–9% клеток-реципиентов поглощают целую хромосому. Способность к естественной трансформации встречается у ряда прокариот, и на данный момент известно, что этот процесс происходит у 67 прокариотических видов (в семи различных типах). Трансформация у Streptococcus mutans, как и у многих других стрептококков, происходит при высокой плотности клеток и связана с образованием биопленки. Компетентность у B. subtilis индуцируется к концу логарифмической фазы роста, особенно в условиях дефицита аминокислот. Аналогично, у Micrococcus luteus (представителя менее изученного типа Actinomycetota) компетентность развивается в средней и поздней фазе экспоненциального роста и также вызывается недостатком аминокислот. Считается, что некоторые бактериофаги способствуют трансформации, высвобождая неповрежденную ДНК хозяина и плазмиды.

Трансформация, как адаптация для восстановления ДНК

Компетентность индуцируется, прежде всего, повреждением ДНК. Например, трансформация индуцируется у *Streptococcus pneumoniae* агентами, повреждающими ДНК – митомицином С (агентом, вызывающим сшивки ДНК) и фторхинолоном (ингибитором топоизомеразы, вызывающим разрывы двойных нитей). У *B. subtilis* трансформация усиливается ультрафиолетовым светом, являющимся агентом, повреждающим ДНК. У *Helicobacter pylori* ципрофлоксацин, взаимодействующий с ДНК-гиразой и вызывающий разрывы двойных нитей, индуцирует экспрессию генов компетентности, тем самым повышая частоту трансформации. Charpentier и соавторы использовали *Legionella pneumophila* и протестировали 64 токсичных молекулы, чтобы определить, какие из них индуцируют компетентность. Из них только шесть – все агенты, повреждающие ДНК – вызвали сильную индукцию. Этими агентами были митомицин С (вызывающий межнитевые сшивки ДНК), норфлоксацин, офлоксацин и налидиксиновая кислота (ингибиторы ДНК-гиразы, вызывающие разрывы двойных нитей), бицикломицин (вызывающий разрывы одинарных и двойных нитей) и гидроксимочевина (индуцирующая окисление оснований ДНК). Ультрафиолетовый свет также индуцировал компетентность у *L. pneumophila*. Charpentier и соавторы провели серию экспериментов с использованием *B. subtilis*, облученного ультрафиолетовым светом в качестве повреждающего агента, чтобы проверить, является ли адаптивная функция трансформации восстановлением повреждений ДНК (обзор представлен Michod и соавторами, а также Bernstein и соавторами). Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащем двухвалентные катионы (часто хлорид кальция), при низких температурах, перед воздействием тепловым импульсом (тепловым шоком). Хлорид кальция частично нарушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникать в клетку-хозяина. Клетки, способные поглощать ДНК, называются компетентными клетками. Было обнаружено, что рост грамотрицательных бактерий в 20 мМ Mg снижает количество белково-липополисахаридных связей за счет увеличения соотношения ионных и ковалентных связей, что повышает текучесть мембраны и облегчает трансформацию. Роль липополисахаридов подтверждается наблюдением, что бактерии с более короткими О-цепочками липополисахаридов трансформируются более эффективно, возможно, из-за улучшенной доступности ДНК. Поверхность бактерий, таких как *E. coli*, имеет отрицательный заряд из-за фосфолипидов и липополисахаридов на ее поверхности, а ДНК также несет отрицательный заряд. Следовательно, одной из функций двухвалентных катионов является экранирование зарядов путем координации фосфатных групп и других отрицательных зарядов, что позволяет молекуле ДНК прикрепляться к поверхности клетки. Попадание ДНК в клетки *E. coli* происходит через каналы, известные как зоны адгезии или соединения Байера, при этом типичная клетка несет до 400 таких зон. Их роль была установлена, когда было обнаружено, что кобаламин (который также использует эти каналы) конкурентно ингибирует поглощение ДНК. Другой тип каналов, участвующих в поглощении ДНК, состоит из поли(HB):поли P:Ca. Предполагается, что поли(HB) обволакивает ДНК (саму по себе полифосфат) и переносится в защитном слое, образованном ионами кальция. Клетки дрожжей могут быть обработаны ферментами для разрушения их клеточных стенок, в результате чего образуются сферопласты. Эти клетки очень хрупкие, но поглощают чужую ДНК с высокой скоростью. Воздействие целых клеток дрожжей на щелочные катионы, такие как катионы цезия или лития, позволяет клеткам поглощать плазмидную ДНК. Последующие протоколы адаптировали этот метод трансформации, используя ацетат лития, полиэтиленгликоль и одноцепочечную ДНК. В этих протоколах одноцепочечная ДНК предпочтительно связывается с клеточной стенкой дрожжей, предотвращая связывание плазмидной ДНК и делая ее доступной для трансформации. Электропорация: формирование временных пор в клеточных мембранах с использованием электрического шока; это позволяет ДНК проникать, как описано выше для бактерий. Для трансформации клеток дрожжей также можно использовать ферментативное переваривание или перемешивание со стеклянными шариками. Эффективность – различные роды и виды дрожжей поглощают чужую ДНК с разной эффективностью. Кроме того, большинство протоколов трансформации были разработаны для пекарских дрожжей *S. cerevisiae* и, следовательно, могут быть не оптимальными для других видов. Даже внутри одного вида различные штаммы имеют разную эффективность трансформации, иногда отличающуюся на три порядка величины. Например, при трансформации штаммов *S. cerevisiae* 10 мкг плазмиды YEp13 штамм DKD 5D H давал от 550 до 3115 колоний, в то время как штамм OS1 давал менее пяти колоний.

Competence is specifically induced by DNA damaging conditions. For instance, transformation is induced in Streptococcus pneumoniae by the DNA damaging agents mitomycin C (a DNA cross linking agent) and fluoroquinolone (a topoisomerase inhibitor that causes double strand breaks). In B. subtilis, transformation is increased by UV light, a DNA damaging agent. In Helicobacter pylori, ciprofloxacin, which interacts with DNA gyrase and introduces double strand breaks, induces expression of competence genes, thus enhancing the frequency of transformation Using Legionella pneumophila, Charpentier et al. tested 64 toxic molecules to determine which of these induce competence. Of these, only six, all DNA damaging agents, caused strong induction. These DNA damaging agents were mitomycin C (which causes DNA inter strand crosslinks), norfloxacin, ofloxacin and nalidixic acid (inhibitors of DNA gyrase that cause double strand breaks), bicyclomycin (causes single and double strand breaks), and hydroxyurea (induces DNA base oxidation). UV light also induced competence in L. pneumophila. Charpentier et al. To test whether the adaptive function of transformation is repair of DNA damages, a series of experiments were carried out using B. subtilis irradiated by UV light as the damaging agent (reviewed by Michod et al. and Bernstein et al. Typically the cells are incubated in a solution containing divalent cations (often calcium chloride) under cold conditions, before being exposed to a heat pulse (heat shock). Calcium chloride partially disrupts the cell membrane, which allows the recombinant DNA to enter the host cell. Cells that are able to take up the DNA are called competent cells. It has been found that growth of Gram negative bacteria in 20 mM Mg reduces the number of protein to lipopolysaccharide bonds by increasing the ratio of ionic to covalent bonds, which increases membrane fluidity, facilitating transformation. The role of lipopolysaccharides here are verified from the observation that shorter O side chains are more effectively transformed – perhaps because of improved DNA accessibility. The surface of bacteria such as E. coli is negatively charged due to phospholipids and lipopolysaccharides on its cell surface, and the DNA is also negatively charged. One function of the divalent cation therefore would be to shield the charges by coordinating the phosphate groups and other negative charges, thereby allowing a DNA molecule to adhere to the cell surface. DNA entry into E. coli cells is through channels known as zones of adhesion or Bayer's junction, with a typical cell carrying as many as 400 such zones. Their role was established when cobalamine (which also uses these channels) was found to competitively inhibit DNA uptake. Another type of channel implicated in DNA uptake consists of poly (HB):poly P:Ca. In this poly (HB) is envisioned to wrap around DNA (itself a polyphosphate), and is carried in a shield formed by Ca ions. Yeast cells may be treated with enzymes to degrade their cell walls, yielding spheroplasts. These cells are very fragile but take up foreign DNA at a high rate. Exposing intact yeast cells to alkali cations such as those of caesium or lithium allows the cells to take up plasmid DNA. Later protocols adapted this transformation method, using lithium acetate, polyethylene glycol, and single stranded DNA. In these protocols, the single stranded DNA preferentially binds to the yeast cell wall, preventing plasmid DNA from doing so and leaving it available for transformation. Electroporation: Formation of transient holes in the cell membranes using electric shock; this allows DNA to enter as described above for bacteria. Enzymatic digestion or agitation with glass beads may also be used to transform yeast cells. Efficiency – Different yeast genera and species take up foreign DNA with different efficiencies. Also, most transformation protocols have been developed for baker's yeast, S. cerevisiae, and thus may not be optimal for other species. Even within one species, different strains have different transformation efficiencies, sometimes different by three orders of magnitude. For instance, when S. cerevisiae strains were transformed with 10 ug of plasmid YEp13, the strain DKD 5D H yielded between 550 and 3115 colonies while strain OS1 yielded fewer than five colonies.

Животные

Введение ДНК в клетки животных обычно называется трансфекцией и рассматривается в соответствующей статье.

Практические аспекты трансформации в молекулярной биологии

Открытие искусственно индуцированной компетентности у бактерий позволяет использовать такие бактерии, как Escherichia coli, в качестве удобного хозяина для манипулирования ДНК и экспрессии белков. Обычно для трансформации E. coli используются плазмиды. Для стабильного поддержания в клетке молекула плазмидной ДНК должна содержать начало репликации, которое позволяет ей реплицироваться в клетке независимо от репликации собственной хромосомы клетки. Эффективность, с которой компетентная культура способна поглощать экзогенную ДНК и экспрессировать ее гены, называется эффективностью трансформации и измеряется в единицах формирования колоний (cfu) на мкг использованной ДНК. Эффективность трансформации 1 × 108 cfu/мкг для небольшого плазмида, такого как pUC19, примерно соответствует 1 из 2000 молекул используемого плазмида, подвергшихся трансформации. При трансформации хлоридом кальция клетки готовят путем охлаждения в присутствии раствора хлорида кальция (CaCl2), что делает клетку проницаемой для ДНК плазмиды. Клетки инкубируют на льду с ДНК, а затем подвергают кратковременному тепловому шоку (например, при 42 °C в течение 30–120 секунд). Этот метод хорошо работает с циркулярной плазмидной ДНК. Некоммерческие препараты обычно должны давать от 106 до 107 трансформантов на микрограмм плазмиды; плохой препарат даст около 104/мкг или меньше, но хороший препарат компетентных клеток может давать до ~108 колоний на микрограмм плазмиды. Однако существуют протоколы для создания суперкомпетентных клеток, которые могут обеспечить эффективность трансформации более 109. Химический метод, однако, обычно неэффективен для линейной ДНК, такой как фрагменты хромосомной ДНК, вероятно, потому, что собственные экзонуклеазы клетки быстро деградируют линейную ДНК. В отличие от этого, клетки, которые естественным образом компетентны, обычно трансформируются более эффективно с помощью линейной ДНК, чем с помощью плазмидной ДНК. Эффективность трансформации при использовании данного метода снижается с увеличением размера плазмиды, поэтому электропорация может быть более эффективным методом для поглощения крупной плазмидной ДНК. Клетки, используемые для электропорации, должны быть предварительно подготовлены путем промывания в холодной дважды дистиллированной воде для удаления заряженных частиц, которые могут вызывать искрение во время процесса электропорации.

The discovery of artificially induced competence in bacteria allow bacteria such as Escherichia coli to be used as a convenient host for the manipulation of DNA as well as expressing proteins. Typically plasmids are used for transformation in E. coli. In order to be stably maintained in the cell, a plasmid DNA molecule must contain an origin of replication, which allows it to be replicated in the cell independently of the replication of the cell's own chromosome. The efficiency with which a competent culture can take up exogenous DNA and express its genes is known as transformation efficiency and is measured in colony forming unit (cfu) per μg DNA used. A transformation efficiency of 1×108 cfu/μg for a small plasmid like pUC19 is roughly equivalent to 1 in 2000 molecules of the plasmid used being transformed. In calcium chloride transformation, the cells are prepared by chilling cells in the presence of (in link=calcium chlorideCaCl2 solution), making the cell become permeable to plasmid DNA. The cells are incubated on ice with the DNA, and then briefly heat shocked (e. g., at 42 °C for 30–120 seconds). This method works very well for circular plasmid DNA. Non commercial preparations should normally give 106 to 107 transformants per microgram of plasmid; a poor preparation will be about 104/μg or less, but a good preparation of competent cells can give up to ~108 colonies per microgram of plasmid. Protocols, however, exist for making supercompetent cells that may yield a transformation efficiency of over 109. The chemical method, however, usually does not work well for linear DNA, such as fragments of chromosomal DNA, probably because the cell's native exonuclease enzymes rapidly degrade linear DNA. In contrast, cells that are naturally competent are usually transformed more efficiently with linear DNA than with plasmid DNA. The transformation efficiency using the method decreases with plasmid size, and electroporation therefore may be a more effective method for the uptake of large plasmid DNA. Cells used in electroporation should be prepared first by washing in cold double distilled water to remove charged particles that may create sparks during the electroporation process.

Отбор и скрининг при трансформации плазмидов

Поскольку трансформация обычно приводит к образованию смеси относительно небольшого количества трансформированных клеток и большого количества нетрансформированных клеток, необходим метод отбора клеток, приобретших плазмиду. Поэтому плазмида требует селективного маркера, чтобы клетки без плазмиды могли быть уничтожены или их рост был остановлен. Устойчивость к антибиотикам является наиболее часто используемым маркером для прокариот. Трансформирующая плазмида содержит ген, который обеспечивает устойчивость к антибиотику, к которому бактерии в противном случае чувствительны. Смесь обработанных клеток культивируют на среде, содержащей антибиотик, так что только трансформированные клетки способны расти. Другой метод отбора – использование определенных ауксотрофных маркеров, способных компенсировать неспособность метаболизировать определенные аминокислоты, нуклеотиды или сахара. Этот метод требует использования подходящих мутировавших штаммов с дефицитом в синтезе или использовании конкретной биомолекулы, и трансформированные клетки культивируют в среде, позволяющей расти только клеткам, содержащим плазмиду. В эксперименте по клонированию ген может быть вставлен в плазмиду, используемую для трансформации. Однако в таких экспериментах не все плазмиды могут содержать успешно вставленный ген. Поэтому могут быть использованы дополнительные методы для дальнейшего скрининга трансформированных клеток, содержащих плазмиду с вставкой. В качестве маркеров можно использовать ген-репортер, например ген *lacZ*, кодирующий β-галактозидазу, используемую в сине-белом скрининге. Этот метод скрининга основан на принципе α-комплементации, когда фрагмент гена *lacZ* (*lacZα*) в плазмиде может комплементировать другой мутантный ген *lacZ* (*lacZΔM15*) в клетке. Каждый ген по отдельности производит нефункциональные пептиды, однако при совместной экспрессии, например, при трансформации клеток *lacZΔM15* плазмидой, содержащей *lacZα*, они образуют функциональную β-галактозидазу. Присутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить при выращивании клеток на пластинках, содержащих X-гал, что приводит к образованию характерных синих колоний. Однако множественный сайт клонирования, куда может быть лигация гена-кандидата в плазмидный вектор, расположен внутри гена *lacZα*. Успешная лигация, следовательно, нарушает ген *lacZα*, и функциональная β-галактозидаза не образуется, что приводит к образованию белых колоний. Клетки, содержащие успешно лигированную вставку, можно легко идентифицировать по белому цвету в отличие от неудачных синих. Другие широко используемые гены-репортеры – это зеленый флуоресцентный белок (GFP), который производит клетки, светящиеся зеленым цветом под синим светом, и фермент люцифераза, который катализирует реакцию с люциферином с выделением света. Рекомбинантную ДНК также можно обнаружить другими методами, такими как гибридизация нуклеиновых кислот с радиоактивным РНК-зондом, а клетки, экспрессирующие желаемый белок из плазмиды, можно обнаружить с помощью иммунологических методов.

Because transformation usually produces a mixture of relatively few transformed cells and an abundance of non transformed cells, a method is necessary to select for the cells that have acquired the plasmid. The plasmid therefore requires a selectable marker such that those cells without the plasmid may be killed or have their growth arrested. Antibiotic resistance is the most commonly used marker for prokaryotes. The transforming plasmid contains a gene that confers resistance to an antibiotic that the bacteria are otherwise sensitive to. The mixture of treated cells is cultured on media that contain the antibiotic so that only transformed cells are able to grow. Another method of selection is the use of certain auxotrophic markers that can compensate for an inability to metabolise certain amino acids, nucleotides, or sugars. This method requires the use of suitably mutated strains that are deficient in the synthesis or utility of a particular biomolecule, and the transformed cells are cultured in a medium that allows only cells containing the plasmid to grow. In a cloning experiment, a gene may be inserted into a plasmid used for transformation. However, in such experiment, not all the plasmids may contain a successfully inserted gene. Additional techniques may therefore be employed further to screen for transformed cells that contain plasmid with the insert. Reporter genes can be used as markers, such as the lacZ gene which codes for β galactosidase used in blue white screening. This method of screening relies on the principle of α complementation, where a fragment of the lacZ gene (lacZα) in the plasmid can complement another mutant lacZ gene (lacZΔM15) in the cell. Both genes by themselves produce non functional peptides, however, when expressed together, as when a plasmid containing lacZ α is transformed into a lacZΔM15 cells, they form a functional β galactosidase. The presence of an active β galactosidase may be detected when cells are grown in plates containing X gal, forming characteristic blue colonies. However, the multiple cloning site, where a gene of interest may be ligated into the plasmid vector, is located within the lacZα gene. Successful ligation therefore disrupts the lacZα gene, and no functional β galactosidase can form, resulting in white colonies. Cells containing successfully ligated insert can then be easily identified by its white coloration from the unsuccessful blue ones. Other commonly used reporter genes are green fluorescent protein (GFP), which produces cells that glow green under blue light, and the enzyme luciferase, which catalyzes a reaction with luciferin to emit light. The recombinant DNA may also be detected using other methods such as nucleic acid hybridization with radioactive RNA probe, while cells that expressed the desired protein from the plasmid may also be detected using immunological methods.